浸水后的代谢恢复


蛹在出水后的最初几小时显示出刻板的恢复模式：没有叠加指示气门打开和关闭的峰值的CO₂排放大初始峰值，可能是因为蛹被积累的CO₂或低pH麻醉；一些浸水个体的较小次级峰值，原因未知但可能反映重要体腔与气管系统的重新连接（可能在此之前被液体阻塞）或蛹某部分有氧代谢的突然重新激活；随后CO₂排放率下降，最后CO₂排放率升高。这些事件的相对时间对于浸水时间更长的蛹被拉长。浸水1天的蛹在约1天后恢复正常的乳酸水平（接近零）和CO₂排放模式，而浸水3天或5天的蛹在2天结束时乳酸水平较低，但即使那时仍有升高的CO₂排放率和改变的呼吸交换模式。


这些数据表明：（1）浸水蛹使用无氧呼吸；（2）恢复早期，蛹要么缺乏对气门的控制，要么被迫因高内部CO₂水平或血淋巴酸化而持续打开气门；（3）从浸水中恢复是一个延长的过程，需要至少数天，可能更长，取决于浸水持续时间；（4）仅去除积累的乳酸不足以实现完全恢复。长时间的代谢恢复让人想起CO₂麻醉后观察到的某些昆虫的长期变化。


呼吸交换模式


浸水对CO₂排放模式有多样影响。最引人注目的模式是大多数浸水后蛹（18只中的12只）显示的连续CO₂排放的高频循环。我们使用术语"循环"来表示与描述的"循环通气"不同的含义：在他们的描述中，循环通气涉及气门短暂但完全关闭，之间有规律的排放峰值——本质上是缩短的DGC，具有非常短的爆发间间隔和没有颤动阶段。如果气门没有完全关闭，他们称之为"连续"呼吸模式。然而，即使他们的连续模式也可以显示规律的排放峰值。在这里，我们使用术语循环来更广泛地描述任何非DGC的节律性排放。


在高频循环期间，蛹以0.78-2.2分钟的间隔排放CO₂峰值。六只对照蛹中有五只在被放入呼吸系统后不久也显示出类似的周期。对照蛹被短暂搬运（<几分钟），表明蛹在应对多种应激源时转变为这种模式。受干扰最小的模式由12小时后的对照蛹显示。它们的排放没有节律性，以一种随机游走的方式波动。这可能表明成对气门对不同体段局部条件的异步作用，使得只有偶尔所有气门同时关闭。


什么潜在机制驱动CO₂的循环排放？最可能的候选者是（1）一个或多个气门的循环打开和关闭，或（2）气门循环和压力驱动气管系统通风的组合。气门受O₂和CO₂的双重控制，由局部、体段内水平调节。神经节中的低O₂信号气门打开。相比之下，高CO₂直接影响气门肌肉，要么通过干扰神经肌肉接头的动作电位传递，要么通过扩散到肌细胞并扰乱局部pH。表明用高水平乳酸灌注的跳蚤在某些气门中表现出高频（每分钟5-15次振荡）波动。这表明烟草天蛾蛹积累的高浓度乳酸影响了气门循环。


蛹中有多少气门振荡？尽管控制是局部的，但局部条件通过气体和血淋巴的纵向运输而耦合。这种耦合振荡器系统可以根据各体段对O₂和CO₂的敏感性以及体段之间的耦合强度给出复杂的控制模式。该过程的一个模型表明，随着耦合强度的增加，较少的气门应该在打开和关闭之间循环。有趣的是，可能在鳞翅目滞育蛹中观察到了这一结果，包括烟草天蛾。使用风速测量技术同时记录多个气门上的对流，他显示烟草天蛾的滞育蛹仅使用单个气门进行所有气体交换。此外，爆发间期约为2分钟，与我们观察到的周期相似。


这些观察表明浸水后蛹的气门状态序列。在最初几小时，高内部CO₂和/或低pH迫使所有气门打开，在此期间CO₂以高速率洗出。最终，CO₂水平下降到足够低，或pH上升到足够高，气门开始在局部关闭。最终，除一个或几个外所有气门都关闭，最后的气门然后开始响应其体段中的局部O₂和CO₂水平循环。


可以驱动CO₂循环排放的第二种机制是对流通气。许多物种的蛹使用血腔中的压力脉动来通气气管，起源于腹部收缩。血淋巴压力的变化驱动进出气门的对流，收缩和气门打开可以协调以产生单向流动。我们实验中的蛹可能使用了这种策略，尽管确认这一点需要额外的工作。

图5. M. sexta蛹在室温水中浸泡1天、3天或5天后的乳酸浓度，以及未浸泡的对照组蛹的乳酸浓度。每个处理组在每个时间点均检测了5个蛹（总计N=70）。柱状图表示±标准误（s.e.m.）。

气门控制模型的挑战


昆虫呼吸生物学中长期存在的问题是解释DGC背后的机制。DGC有三个阶段：关闭阶段，气门密封关闭，无气体交换；颤动阶段，气门短暂打开，让少量O₂进入并可能让出CO₂；开放阶段，气门打开数分钟，在此期间气管系统中的O₂水平迅速接近环境，大量CO₂被排放。我们研究中的两只蛹显示了DGC，其他蛹在其他模式上叠加了可能的DGC。最近提出了两个DGC模型——第一个提出了DGC从O₂和CO₂阈值之间的相互作用中产生。


当气门关闭时，气管O₂分压高，CO₂分压低。由于系统密封，昆虫的代谢降低PO₂并提高PCO₂。即使有氧代谢基本上每消耗一个O₂分子产生一个CO₂分子，气管PO₂下降速度也比PCO₂上升速度快，因为大部分CO₂溶解到组织和血淋巴中。一旦气管PO₂降至其阈值，气门开始颤动，短暂打开让O₂进入。颤动频率可能改变以将气管系统中的PO₂调节到相对恒定的低水平。颤动也可以让出CO₂，取决于气门之间是否有抽吸通风。无论哪种方式，CO₂继续积累，在某点达到CO₂阈值并触发气门长时间打开。在其原始形式中，该模型可能充分描述了我们实验中两只蛹观察到的DGC。然而，该模型无法解释大多数其他蛹观察到的高频循环。检查的默认参数集给出的爆发间期约为10分钟。在敏感性分析中，几乎所有合理的参数值集都给出10分钟或更长的循环时间。

图6. 螺孔调控的相空间模型。(A) Forster 和 Hetz（2010）提出的不连续气体交换周期（DGC）模型，该模型设定了两个螺孔开启阈值：一个在气管氧分压（PO2）较低时，另一个在二氧化碳分压（PCO2）较高时。当螺孔关闭（收缩）时，气管PO2下降而PCO2上升，直至PO2最终降至低于氧气阈值；此时螺孔开始颤动，允许少量氧气进入但无法排出等量的二氧化碳。此时PCO2随之升高并最终超过二氧化碳阈值，螺孔随即完全打开（爆发式开启）较长时间，以释放积聚的内部二氧化碳。(B)另一种轨迹情况：从浸没环境中恢复的蛹体内积累了大量二氧化碳（Harrison 等，1995），导致二氧化碳在气管系统中的生成速率远高于氧气的消耗速率。若如此，则在螺孔关闭时相空间曲线的斜率较为平缓，从而在气管PO2降至二氧化碳阈值之前就触及PCO2阈值。另一种可能性是：浸没后蛹体在血淋巴中储存二氧化碳的能力较低——例如当组织及血淋巴因乳酸等其他来源酸化时（见图5），这将使二氧化碳与碳酸氢盐之间的平衡向二氧化碳方向偏移。若浸没或缺氧状态降低了血淋巴中非碳酸氢盐缓冲物质的浓度，也可能产生类似效应（Harrison ，2001）。与上述第一种情况类似，这些过程会导致二氧化碳以较高速率出现在气管系统中，从而导致相空间中的曲线斜率变平。反证观点认为：即使对照组蛹在处理后仍呈现循环现象，其体内也不会积累二氧化碳；此外，在为期两天的测量期间大部分时间持续表现出循环现象的蛹（即第3天和第5天浸没组），其体内高水平的二氧化碳不太可能长期维持。(C)第二种替代模型认为：气管内PO₂和PCO₂的变化动态正常，但二氧化碳阈值降低——这可能是由各种应激因素或乳酸所致。(D)相空间中的另一种替代模型则表明：组织和血淋巴中二氧化碳的释放极为迅速，且循环周期极短，使得整个循环过程中气管系统的PCO₂始终维持高位。要区分这些不同模型需进行进一步实验验证。

在模型的扩展中，检查了双阈值方法的额外细节，关注CO₂/pH触发气门打开和关闭。该模型使用直翅目数据参数化。作者检查了四种触发（阈值）情景，调用单一或双重触发和不同的生理现实机制。敏感性分析揭示了一系列潜在的打开和关闭模式，包括具有正确时间安排的完整DGC。关于我们观察到的高频波动，他们最有趣的触发系统是TS1。它在检查的所有参数组合下都未能产生DGC，表明它没有捕捉到某些基本方面。然而，它是唯一产生短开放阶段的系统，其中一些<1分钟长，间隔关闭阶段>10分钟。也许随着组织中储存的CO₂额外快速流入气管系统，这样的模型可以产生周期约1分钟的循环。


这些模型显著推进了我们对气门行为的理解。然而，没有一个模型产生足够短的循环来解释我们的烟草天蛾数据，而且最接近的版本否则无法生成DGC。因此，我们仍在等待一个能够捕捉观察到的全部范围的未来模型。


蛹缺氧对成虫形态没有长期影响


浸水的危险可能来自缺氧本身，或来自气管系统再灌注期间产生的ROS的氧化损伤。两者都可以解释浸水7天或更长时间的蛹的死亡。然而，从浸水5天或更短的蛹羽化的成虫在从蛹表皮中逃脱和展开翅膀方面没有困难，并且没有显示其他外部异常。可能存在我们遗漏的内部或生化异常。这些结果表明，存活的蛹没有因缺氧或再灌注遭受其他长期影响。


结论


烟草天蛾的蛹通过使用无氧呼吸，在水中存活最多5天。在恢复期间，它们排放大量CO₂，显示多样的CO₂循环排放模式，并迅速分解积累的乳酸。浸水蛹没有变态成异常成虫，但那些经历较长浸水时间的蛹在恢复期间显示出CO₂排放模式的长期变化。在生活阶段中，蛹对浸水最耐受，可能反映了它们偶尔浸水的进化史。这些发现表明，烟草天蛾的蛹将成为进一步研究浸水、缺氧耐受性和昆虫气体交换模式背后机制的良好模型系统。最后，CO₂排放的高频循环对当前的气门控制模型提出了有趣的挑战。未来模型应检查在高CO₂产生（来自溶解气体和碳酸氢盐）与相对低O₂结合的条件下气门的行为。


致谢


感谢Thomas Förster发送他的R包SableBase，我们用它将Expedata文件读入R。还要感谢Scott Kirkton、Chelle Terwilliger、Harmen Steele和Sandy Ross对乳酸测定的建议和支持，以及Keaton Wilson饲养我们使用的一些昆虫。Thomas Förster和Scott Kirkton对稿件的早期草稿提供了宝贵意见。我们还要感谢两位匿名审稿人对初稿的建设性意见。



利益冲突


作者声明没有竞争或财务利益。


作者贡献


H.A.W.和S.J.L.设计了实验，S.J.L.进行了实验。H.A.W.和S.J.L.分析了结果，H.A.W.撰写了稿件。


资助


这项工作部分由国家科学基金会资助（IOS 0844916给H.A.W.）。


数据可用性


数据可从Dryad数字存储库获取。