在1天浸水组中，规律的CO₂排放循环大约在2小时开始，循环幅度迅速增加，在出水后4-6小时达到高水平。在浸水3天的蛹中，循环在出水后3-4小时开始，循环幅度缓慢增加至约12小时；一般来说，3天组的循环幅度从未达到1天组的水平。在浸水5天的蛹中，循环在出水后4-10小时开始，对于某些蛹，循环幅度在整个2天测量期间继续增加。除了循环的开始外，对于大多数蛹，代谢率在循环开始或数小时后出现明显的下降然后增加。

图2. 浸没恢复实验中M. sexta蛹（N=24）的二氧化碳排放轨迹。大多数蛹的排放数据记录了48小时，但其中一部分样本（N=6）仅记录了24小时。原始数据采样频率为1 Hz，为绘制本图而将其降采样至0.1 Hz。灰色水平线代表每只蛹的0 ppm值，各灰色线条间距为120 ppm。垂直箭头表示每只浸没蛹根据气孔活动增强与刻板性休眠后二氧化碳平均排放量相对突然上升同时出现的现象，所估算的恢复正常呼吸功能的时间点。右侧列包含额外描述信息：性别（f=雌性，m=雄性）；滞育状态（y=否，进入滞育期；n=否，未进入滞育期）；以及结局（e=成功羽化为成虫，d=在蛹期死亡，e*=在羽化过程中死亡）。问号表示缺失数据。


对照组和实验组中的大多数蛹在恢复期间数小时内显示出明显的高频CO₂排放循环，一些来自较长浸水组的蛹在循环开始后整个迹线都显示该模式。循环发生在两个时间尺度上。24只蛹中有17只显示高频循环，CO₂排放峰值的平均周期为1.56分钟（范围0.78-2.17分钟），24只中有13只显示低频循环，平均周期为12.4分钟（范围6.5-31分钟）。总样本量大于24，因为一些蛹同时显示两种循环频率。周期通过检查自相关函数中0-10分钟或更长滞后的主要峰值的时间来发现。我们观察到至少三种可辨别的高频循环变体。一些蛹，特别是对照组中的蛹，以低水平排放CO₂并有规律的短暂脉冲。其他蛹的速率在高和低之间对称循环，但不降至零；这些主要来自5天浸水组。第三组有连续的高水平排放，伴有短暂下降；这些主要来自3天浸水组。两只蛹（编号1和20）显示出清晰的DGC模式。然而，只有第一只蛹在长开放阶段之前有明确的颤动，该个体的颤动周期为1.67分钟。因此，CO₂排放速率似乎存在共同的1-2分钟周期的高频振荡。

图3. 烟草天蛾中CO₂排放的多种循环模式及其对应的自相关函数。（A）一只对照蛹（ID 1），在放入呼吸测量室约5小时后表现出不连续气体交换循环（DGC）；其自相关函数仅适用于17.3至18.3小时之间的颤动期。（B）同一蛹在3–5小时期间，显示出循环通气。（C）来自5天浸没组的蛹22，表现出高度规则的CO₂排放循环。（D）来自3天浸没组的蛹18，表现为大部分时间高排放但被短暂的“反爆发”低排放所打断。（E）来自3天浸没组的蛹13，展示了（D）模式的极端版本。对应的自相关函数显示在（F–J）中。


即使在循环开始后，代谢迹线在处理组之间也存在差异。1天组的模式在出水后约10小时开始基本稳定。然而，这些迹线仍然不像对照组：1天蛹在其余测量期间有更多的高频波动。3天组的蛹在出水后12-24小时大多有非常高频的波动，24小时后以较长频率为主。5天组的蛹在48小时测量期间大多有非常高频的波动，它们的迹线最不稳定。


各组在出水后的平均代谢率随时间存在一致差异。无浸水组的蛹代谢率低（0.2-0.3微摩尔CO₂/分钟）。浸水组的平均排放率取决于浸水长度。在第一个小时（与初始峰值相关的高平均CO₂排放率；见图2）之后，蛹显示出50-75%的代谢率增加，峰值在不同时间达到：1天蛹在出水后10-12小时达到峰值，3天蛹从18到48小时显示峰值，5天蛹在48小时迹线结束时逐渐上升到该水平。推测如果我们继续测量，3天和5天浸水组的蛹在2天后会表现出下降的CO₂排放率。

图4. 烟草天蛾蛹出水后的平均CO₂排放速率。数据表示为各浸没组的均值±标准误。对照组（0天浸没）的数据来自6只蛹；1天、3天和5天浸没组各来自6只蛹。注意1天浸没组的曲线在约10–12小时达到峰值后下降，而3天和5天浸没组的曲线在整个48小时内持续上升或维持在高位。

乳酸的积累和清除


对照蛹的初始乳酸水平最低，浸水时间越长的蛹乳酸水平越高。仅浸水1天的蛹乳酸水平迅速下降，在下一个取样时间点（12小时）接近零。浸水3天或5天的蛹水平下降更慢，但所有组在48小时达到与对照组无法区分的水平。鉴于数据看起来有些S形，我们尝试对各个浸水组（1、3和5天）拟合三参数S形方程；然而，非线性拟合程序在某些情况下未能收敛。作为替代，我们对三个实验组拟合了双向方差分析，以浸水天数和出水后小时数为因素。拟合结果确认了图中观察到的模式：两个因素及其交互作用都高度显著。


讨论


浸水存活


尽管烟草天蛾表面上是陆生的，但蛹而不是幼虫能够在水中存活5天。这种蛹生理学可能反映了偶发但危险的事件的进化结果，在这些事件中，大雨局部饱和土壤或导致溪流和河流泛滥并产生持久的积水。在我们的实验中，周围水中的O₂水平不影响存活率，表明蛹没有通过表皮或气门吸收O₂或通过隐蔽的表皮空气膜交换气体。相反，浸水蛹积累了高水平的乳酸，表明它们依赖无氧代谢；我们没有关于其他可能的无氧终产物的信息。尽管我们没有直接探索其影响，温度可能在设定存活时间方面起重要作用。蛹在22°C下浸水，这是我们在亚利桑那州东南部主要野外地点8厘米深度典型的夜间土壤温度。相比之下，冬季滞育的蛹代谢需求较低并经历较低温度，这可能延长存活时间。


跨生活阶段，对缺氧的差异耐受性很常见，烟草天蛾也不例外。在我们的实验中，蛹存活更长时间（最多5天）而幼虫则不能（不超过4小时）。除了比幼虫更容易洪水外，蛹还具有低得多的质量特异性代谢率，这应该促进缺氧耐受性。在我们的研究中，非浸水蛹的CO₂排放率在3.0-3.4微摩尔/克/小时的范围内，比五龄幼虫低一个数量级（30-50微摩尔/克/小时）。在几种情况下，出水的幼虫最初恢复了体膨压和移动能力，但随后在24小时内死亡，表明它们因长时间缺氧或再灌注而遭受了重大损伤。虽然这里未研究，但卵和成虫似乎对缺氧具有中等耐受性。因此，幼虫对缺氧最敏感，蛹最不敏感，卵和成虫介于两者之间。这种模式与提出的方案形成对比，其中卵和成虫被认为是最敏感的。我们提出，最可能经历浸水的生活阶段将对缺氧和低氧最不敏感。


与其他物种相比，烟草天蛾蛹在浸水（缺氧）中的存活时间令人印象深刻但并非前所未有。虎甲（Cicindela togata）的幼虫经常在自然界中被洪水淹没，在纯N₂中存活超过4天，而相关物种（Amblycheila cylindriformis）的幼虫不被洪水淹没，存活不到1.5天。豆象（Callosobruchus subinnotatus）的蛹和羽化前成虫生活在bambarra种子内，可能自然暴露于缺氧，在仅含1%O₂的大气中存活超过4天。一些在低温下保存的高山昆虫可以存活缺氧超过100天。


使用浸水而不是纯N₂使解释复杂化，因为浸水昆虫有时从周围水中获取O₂。确实，我们怀疑浸水蛹因内部CO₂积累或身体pH变化而打开气门，而水由于开口直径小和高度疏水性表皮而无法进入气管系统。如果是这样，将有一个小的总面积（所有气门的总和）的气-水界面，气体原则上可以在其上移动。然而，我们的实验表明这种交换可以忽略不计，因为烟草天蛾蛹在充气和N₂净化水中的存活率没有差异。其他物种可能使用物理机制获取氧气。例如，几种洪泛区地面甲虫的成虫可以使用被困在鞘翅下的空气作为物理鳃，在冷水中存活10天的浸水。我们提出，无氧过程在短时间（数天）内是有用的，但较长时间的存活需要非常低的温度或从水中提取氧气的机制。