4 讨论


在本研究中，我们聚焦于pH和PO₂作为BA啮齿动物模型中脑内环境的两个关键变量。我们检查了多种实验范式引起的扰动的幅度和时间进程，包括严重和中度窒息，以及单独的严重和中度缺氧和高碳酸血症（见材料与方法）。这使得能够识别适应性机制，指向未成熟啮齿动物大脑应对与窒息相关的低O₂水平的显著能力，这先前已在大型哺乳动物（如绵羊和猪）的广泛研究中得到证实。此外，我们的实验表明，这些适应性机制在纯缺氧期间不起作用，这是哺乳动物在自然条件下产前、围产期或产后从未面临过的状况。目前的数据还将增进我们对BA期间影响体内神经元兴奋性的条件的理解。最后，我们证明，在一段窒息期后减缓正常碳酸血症的恢复将延长先天脑保护机制以及高碳酸血症本身的作用。


我们关于pH的主要观察是（a）虽然窒息的高碳酸血症成分是导致脑和体pH中看到的大部分大而快速的酸中毒的原因，但脑似乎受到保护免受更缓慢发展的代谢性酸中毒。我们发现（b）与窒息不同，暴露于缺氧产生小而立即触发的脑局限性碱中毒，同时伴有体中缓慢且同样适度（按定义是代谢性的）酸中毒，指向BBB酸排出的能力以超过脑内净酸产生的速率，如先前假设的。缺窒息后脑pH的快速恢复速率被GRN显著降低，这一效应对新皮层癫痫发作具有显著的抑制作用，如Ala‑Kurikka等人在平行研究中所示。值得注意的是，在目前使用麻醉和略低的体温33.5–34°C（见材料与方法）vs 36.5–37°C的工作中，未发生癫痫发作。


关于氧水平，我们发现如果单独应用缺氧，或将其作为窒息的两个组成部分之一应用，存在显著差异。在缺氧（5%或9%O₂）以及严重实验性窒息（即20%CO₂加5%O₂）期间，脑和体PO₂均降至接近零的水平。然而，在20%CO₂高碳酸血症并行下使用9%O₂（中度窒息），脑恢复其对照PO₂水平，指向高度有效的适应性机制的激活。此外，我们的记录显示脑（和体）的短暂窒息后过冲，被GRN延长。


上述效应及其机制和后果将在下面详细讨论。


4.1 走向有效的BA啮齿动物模型


4.1.1 模型特征


选择研究BA的实验模型并非一项简单的任务。显然，体外模型不能再现对窒息的系统水平适应性反应。由于大鼠和小鼠后代的晚成性，其皮层发育在P6左右对应于人类早产（从28至35孕周），在P11左右对应于足月婴儿。因此，实验操作必须以再现这些产后动物中窒息模拟条件的方式设计，这些动物已经获得了完全功能的肺通气。


我们模型的主要特征如下：（a）它是非侵入性的，因此内源性血管运动和其他系统水平（如神经激素）保护机制保持完全运作。（b）通过脐带受损的气体交换，导致胎儿中CO₂积累和O₂缺乏，通过升高环境气体中的CO₂和降低O₂来模拟，而不是将动物暴露于阻断窒息特征性呼吸性酸中毒的缺氧气体（见下文关于窒息与缺氧的部分）。（c）实验操作针对整个幼鼠，其适应性反应和其他生理反应的组织器官分布源于内源性。（d）此外，我们的pH和乳酸数据表明，当前模型再现了人类新生儿严重BA的关键临床标准，即全身性酸中毒至pH水平<7.0和碱缺失≥12mmol/L。关于高碳酸血症，出生时严重酸中毒新生儿的脐动脉血气分压（Pa）值通常>100mmHg PaCO₂（≥140mmHg在>10%的病例中），PaO₂通常在10至15mmHg范围内。因此，在当前模型的所有三个版本中（中度、重度和间歇性窒息），CO₂保持在恒定20%水平，而O₂降至9%或5%，以揭示动物在氧资源有限的情况下维持脑氧合的完全激活的内源性能力。


新生豚鼠是早成性的，因此其出生时的大脑比晚成性新生大鼠成熟得多。然而，我们对P0至P2豚鼠（就皮层发育而言对应于两到三周龄大鼠）的结果与P6和P11大鼠获得的结果在质量上相同，甚至在数量上相似，表明目前的实验方法在所有标准实验啮齿动物的转化工作中均有效。


4.1.2 窒息 vs. 缺氧


我们目前关于纯缺氧诱导的脑碱中毒的数据反对缺氧模型对窒息的相关性。另一条重要证据来自缺氧对神经元兴奋性的实验。尽管氧剥夺期间激活了许多嘌呤能机制，单独体内缺氧已知产生皮层兴奋性的显著增加，这在挑战期间表现为癫痫发作。如果确实，缺氧模型旨在模拟临床BA中发生的情况，这将意味着与复杂分娩相关的新生儿癫痫发作已经在子宫内和分娩期间被触发。显然情况并非如此。BA缺氧模型中缺失的是高碳酸血症，以及随之而来的呼吸性酸中毒，后者通过调节广泛的电压和配体门控离子通道降低脑兴奋性。因此，虽然缺氧促进新皮层兴奋性，高碳酸血症酸中毒具有功能上相反的效果。值得注意的是，这与窒息引起的新生儿癫痫发作在出生后substantial delay（数小时）发生的事实一致，即在常氧条件已经建立时。从一般神经生物学角度来看，有趣的是，在所有自然条件下，体内缺氧与高碳酸血症相关，表明pH神经调节效应发展的进化历史，其中……


因此，脑pH的恢复可能是设定窒息恢复期间脑兴奋性增加时间进程的因素。值得一提的是，在我们先前的研究中，我们使用异氟烷而非乌拉坦麻醉，初始麻醉深度可能太深，这也可能解释了与目前研究相比基线脑pH显著低（>0.1单位）的原因。这些差异可能解释了为什么在目前的研究中，我们未检测到与先前研究一样大的净窒息后脑碱中毒。


4.1.3 脑保护系统水平机制


为保留关键依赖氧合的胎儿脑，窒息触发通常称为外周化学反射或脑保留效应的系统水平内源性保护机制。这些保护反应涉及血管扩张和血管收缩，作用于维持脑、心脏和肾上腺等关键、高度依赖氧气的器官的灌注，从而降低BA后HIE的风险。


虽然监测CBF的研究为维持脑氧合的适应性反应提供了线索，但显然CBF数据不能提供窒息期间脑组织氧水平的直接信息。例如，窒息期间CBF增加，但同时不仅O₂可利用性大幅下降，血pH也大幅下降，后者由于Bohr效应降低了血液的氧携带能力。因此，脑组织中PO₂的测量提供了这一关键变量的直接定量信息，正如本研究中的情况。窒息期间脑氧合CO₂依赖性的直接证明是，虽然通过降低环境O₂至9%引起的缺氧导致脑PO₂近瞬间降至约基线水平的十分之一，但当相同水平的缺氧与高碳酸血症结合时，脑实质中几乎占优势的常氧条件。间歇性窒息期间对9%O₂的脑PO₂反应似乎表明，这种脑保留效应通过降至低（5%）O₂水平的步骤而增强——这一发现类似于先前在BA绵羊模型中对脐带闭塞反应的报道。然而，每个9%O₂期结束时达到的峰值水平中观察到的脑PO₂增加趋势（见图2条形图插图）与持续9%O₂窒息期间看到的没有差异，表明在当前实验设置中持续和间歇性窒息期间化学反射的增强相似。


我们关于高碳酸血症时不仅脑PO₂而且体PO₂（皮下测量）均增加的发现，并不意味着两者基于相同的机制。高碳酸血症时人类皮下PO₂也增加，但这种效应是由心输出量增加引起的，而非血管扩张，后者已知是CBF增加的关键介质。


使用P6和P11大鼠获得的结果显示这两个发育阶段之间仅有微小差异。因此，就窒息的系统水平代谢和脑保留方面而言，我们的模型可用于研究不同皮层发育阶段的围产期窒息，对应于早产至足月人类婴儿。通过吸入气体诱导窒息提供一种直接的方法，可生成持续和间歇性窒息方案。这些方案大致对应于两种机制不同的围产期并发症：急性胎盘功能不全和延长……