3.4 间歇性窒息揭示高碳酸血症对脑的增强效应


为深入了解pH和PO₂对发育阶段和窒息严重程度的依赖性，我们使用实验范式模拟BA典型的间歇性O₂供应。在此，我们使用P6和P11幼崽，就大脑皮层发育阶段而言，分别大致对应于早产和足月婴儿。


在P6大鼠中，9%/5%O₂间歇性窒息（见图2方案；及材料与方法）引起脑和体pH的酸偏移和恢复，特征与持续5%O₂窒息非常相似，但两个区室的酸中毒幅度较小（窒息结束时脑6.81±0.01和体6.76±0.014，n=8；图2A）。与此一致，跨BBB电位的反应与持续窒息的差异主要在于幅度略小。吸入气体混合物中5%和9%O₂之间的交替在两个pH信号中引起相对较小的偏移（<0.035）。间歇性窒息预计比持续窒息诱导更小的代谢性酸中毒，这确实在脑和体pH迹线中显而易见，前者分歧小得多（比较图1A和图2A中ΔpH迹线阴影区域下的部分）。


对PO₂反应，特别是脑中PO₂反应的有趣观察，是在间歇性窒息中做出的（脑n=8，体n=4；图2A）。窒息开始时，在9%O₂/20%CO₂下，两个PO₂信号迅速下降，但在一分钟内开始恢复，表明某些补偿机制的激活。在随后的5分钟5%O₂期间，脑和体PO₂均降至零，方式类似于5%O₂窒息条件下的情况。当O₂随后从5%增加至9%持续5分钟时，尽管环境O₂持续处于缺氧水平，脑PO₂开始快速恢复至其对照水平。在随后三次升至9%水平的过程中，脑PO₂上升幅度更大，在最后一次9%期间达到——在8只动物中的5只超过——窒息前对照水平（图2A）。值得注意的是，并行的体PO₂部分恢复要小得多，其最终峰值约为对照水平的一半，表明上述假设的补偿机制在体中作用更小。

图2 P6和P11大鼠在间歇性窒息条件下诱导的pH和PO₂反应。(A)同时记录了脑组织、全身pH以及 VBBB 中对45分钟间歇性窒息的反应，并与另一组其他实验条件完全相同的实验中获得的脑组织及全身PO₂反应数据并列展示。(A)中的所有数据均来自P6大鼠。(B)与(A)类似，但对P11大鼠施加了30分钟的间歇性窒息。(A)和(B)中的柱状图插图显示了在每次吸入9%氧气和20%二氧化碳的5分钟周期结束时达到的平均脑组织及全身PO₂的最大值。

恢复至空气引起脑和体PO₂的短暂过冲，与5%O₂持续窒息后观察到的非常相似。与持续窒息相比，间歇性窒息的严重性较低，可能解释在恢复后约30–60分钟时间间隔内体PO₂未出现低于其基线水平的下冲。


上述结果清楚地表明，即使在P6窒息期间有限的O₂来源也足以恢复脑中的常氧条件。在发育过程中，伴随血管生成的能量代谢增加预计会对脑pH和PO₂反应产生影响。因此，我们接下来对P11大鼠使用间歇性窒息模型，基于初步实验，我们将暴露持续时间缩短至30分钟以保持死亡率为零。P11大鼠的平均基线脑pH（7.31±0.01，n=11）与P6无差异（P=0.91），但基线体pH略高（7.41±0.02，n=11，P=0.0043）。P11大鼠的平均基线脑PO₂（31.7±0.91mmHg，n=22）明显高于P6大鼠（P=5×10⁻¹²）。P11的体PO₂也有类似的增加（34.2±2.06mmHg，n=22；P=0.0043）。从图2B可以看出，P11间歇性窒息诱发的反应与P6相比没有明显差异。在一系列类似图S1B但针对P11的高碳酸血症实验中（未图示），三种CO₂水平（5%、10%、20%）下PO₂的增加在脑和体中均与P6无差异（P值0.38至0.94，n值4至10）。与P6大鼠一样，P11大鼠在9%O₂缺氧期间（15分钟暴露；脑和体分别为n=6和4；未图示）脑和体PO₂均迅速降至零，恢复期PO₂反应与P6相比无明显差异。


3.5 新生豚鼠维持更高的脑氧合


豚鼠是一种在BA和其他早期生命障碍的转化研究中被使用的啮齿动物。该物种适应高海拔生活，其早成性新生仔在出生时就大脑皮层发育阶段而言，比晚成性新生大鼠和足月人类新生儿要成熟得多。因此，为进一步研究脑反应的发育和种间方面，我们使用P6和P11大鼠以及P0–2豚鼠，并比较它们在暴露于持续5%或9%O₂窒息15分钟时的脑和体PO₂反应。


如预期，5%O₂窒息导致P6和P11大鼠脑PO₂迅速降至接近零水平，在15分钟窒息期间几乎无进一步变化（分别为n=10和7；图3A上和中面板）。两个年龄组的恢复均包含短暂上升，峰值约为基线PO₂值的两倍，随后在大约15分钟内缓慢降至基线水平。同时的体PO₂反应与脑中相似，但动力学稍慢，恢复过冲较低（P6和P11大鼠均为n=4）。


中度9%O₂持续窒息15分钟在P6和P11大鼠中再次显示典型的短暂过冲恢复，但窒息期间脑和体PO₂水平存在微小差异（图3B上和中面板）。在P6，非常短暂的下降后脑PO₂上升至基线或甚至高于基线的水平，而体PO₂信号从初始下降中恢复较慢，并稳定在其基线以下（分别为n=6和5），即在9%O₂持续窒息期间脑和体分别处于轻度高氧和低氧状态。在P11，脑和体PO₂的初始下降更大，只有脑PO₂在窒息期间显示部分恢复，达到其基线值的76.7±6.5%，而体PO₂稳定在其基线水平的27.1±10.7%（均为n=4；图3B中面板）。


在P0–2豚鼠中，基线脑和体PO₂分别为31.6±1.6mmHg（n=5）和43.2±6.8mmHg（n=3）。与P6大鼠类似，豚鼠脑组织在9%O₂窒息期间除最初<1分钟外未变为低氧，而是迅速上升至5分钟时高于基线9.2±2.0mmHg的水平，然后在恢复至呼吸空气引起非常短暂的过冲至82.9±2.3mmHg之前缓慢向基线水平下降（n=5；图3B下面板）。豚鼠体PO₂对9%O₂窒息的反应也与P6大鼠相似（窒息结束时，体PO₂降至33.1±0.7mmHg，n=3，即基线的81.3±15.4%）。有趣的是，在严重5%O₂窒息期间，豚鼠与P6和P11大鼠不同，其脑PO₂迅速降至窒息前基线的35.4±5.4%的短暂最低值，然后增加并保持在不低于基线的61.0±9.9%（16.9±1.9mmHg）直至窒息结束（n=5；图3A下面板）。同时记录的体PO₂显示更显著的进行性下降，在15分钟5%O₂窒息结束时达到8.7±3.2mmHg，即窒息前基线的22.0±8.1%（n=3），恢复期间伴有中度过冲。

图3 大鼠P6和P11日龄以及P0-2日龄豚鼠在严重及中度缺氧条件下脑组织与全身氧分压（PO₂）的反应。(A)顶部、中部及底部面板分别显示暴露于5%氧气缺氧环境15分钟的P6和P11日龄大鼠以及P0-2日龄豚鼠脑组织与全身PO₂的个体记录曲线及平均值叠加曲线。(B)与(A)类似，但采用中度缺氧条件（9%氧气浓度）。

3.6 窒息恢复期间GRN对脑和体pH及脑PO₂的影响


窒息恢复期间应用的GRN（Gradual Return to Normocapnia，分级恢复正常碳酸血症）作为一种保护脑和改善预后的治疗干预具有前景。因此，在一系列广泛的实验中，我们专注于持续和间歇性窒息。


与P6大鼠在45分钟持续5%O₂窒息后快速恢复正常碳酸血症（RRN）期间看到的快速pH恢复相反，GRN期间脑和体的恢复均有三个不同的阶段（图4A）。如预期，pH恢复的这些阶段与环境中CO₂水平的变化平行，因此脑和体pH恢复至基线的速度比RRN慢得多。GRN期间，体pH保持低于脑pH（见图4A中的ΔpH），恢复结束时的最终pH水平与RRN看到的相同（分别为P=0.62和P=0.76）。同样，V_BBB信号紧密跟随pH变化的时间进程。突然的V_BBB崩溃与本研究中使用的任何实验性损伤均无关，这表明损伤未导致BBB破坏。


在P6的平行实验中，窒息后脑PO₂的短暂过冲在水平（77.9±5.7mmHg，n=4）处迅速达到峰值，几乎是基线的三倍，高于且宽于RRN期间看到的峰值（参见图S1A；峰值高度比较P=0.31）。此后，在30分钟暴露于10%CO₂/20%O₂气体期间，PO₂略微下降（至63.6±6.1mmHg），当CO₂降至5%时脑PO₂进一步下降。下降缓慢，30分钟内未达到稳定水平（窒息后60分钟脑PO₂32.5±5.0mmHg）。窒息后60分钟恢复至空气使脑PO₂降至轻度低氧水平。


P11大鼠在30分钟间歇性窒息后GRN的效果（n=4；图4B）与上述P6大鼠的描述一致。脑PO₂的峰值高于且宽于P11的RRN。与P6的GRN相比，在10%和5%CO₂的30分钟恢复期间，稳定的脑PO₂水平更快达到，这些水平分别约为平均基线的2倍和1.3倍。恢复至空气引起脑PO₂降至低氧水平（21.5±1.3mmHg），随后缓慢趋向原始基线。

图4 在窒息恢复过程中逐步恢复正常碳酸血症会延缓P6和P11大鼠的碱性恢复进程，并延长其PO₂峰值上升时间。(A)P6大鼠经历5%窒息环境45分钟后，通过逐步恢复正常碳酸血症进行恢复：即立即恢复正常的环境氧浓度；吸入气体中的二氧化碳先降至10%持续30分钟，随后降至5%再维持30分钟，最终动物恢复正常呼吸。同时记录的大脑与身体pH及 VBBB 值的个体轨迹与平均值曲线与另一组完全相同的实验中脑PO₂数据并列显示。(B)实验设计与(A)类似，但使用P11大鼠并采用间歇性窒息30分钟，且同步记录身体PO₂与脑PO₂数据。其中一条身体PO₂曲线与其他P11大鼠的对应曲线存在偏差，可视为数据中的异常值。但由于未能在早期恢复阶段找出导致这种非典型行为的技术原因，我们未将该记录排除在数据分析之外。