3 结果


3.1 P6大鼠中窒息、高碳酸血症和缺氧诱导的脑和体pH变化


出生窒息与全身性酸中毒相关，由于CO₂积累和O₂缺乏，分别具有呼吸性和代谢性成分。我们首先对P6大鼠进行了一系列实验，以分析细胞外脑pH和皮下组织pH（分别为脑pH和体pH；见材料与方法）的变化。使用pH敏感微电极记录体pH是连续的，因此避免了与反复采血相关的问题，并提供与血pH良好相关的全身性pH连续测量。下面，我们还分别讨论了窒息的两个组成部分——缺氧和高碳酸血症——对脑和体pH的影响。


3.1.1 持续窒息


P6所有实验中基线平均脑pH为7.31±0.01（均值±标准误，n=32）。窒息（5%O₂和20%CO₂；45分钟）立即引起脑pH快速下降，随后以较小幅度非常缓慢且进行性酸化（图1A）。前10分钟内pH下降为0.47±0.01（n=6），最大下降速率为每分钟0.21±0.02pH单位，而随后的缓慢酸化为0.10±0.02，速率为每分钟0.003±0.0005pH单位，在45分钟窒息期结束时达到最终pH6.75±0.02。


窒息后脑酸中毒的恢复非常快（图1A）。它由两个阶段组成，前15分钟是窒息诱导的pH快速下降的镜像，约20分钟后进入第二阶段。与先前在更中度窒息（9%O₂和20%CO₂）下观察到的脑pH变化相比，目前的结果不同之处在于（a）脑pH在窒息期间没有开始恢复，而是缓慢下降直到窒息期结束，以及（b）恢复期结束时的最终pH水平仅略高于初始基线pH（高0.05±0.02，P=0.034）。


P6所有实验中基线平均体pH为7.34±0.01（n=32）。与窒息期间脑pH反应相反，体pH变化没有两个动力学上不同的阶段。尽管最初比脑慢（体和脑平均pH酸中毒的最大速率分别为每分钟0.051和0.21pH单位），体pH下降在45分钟时达到更高的幅度0.70±0.02pH单位（n=6，P=0.00007，配对t检验；pH6.65±0.02）。此外，体pH的恢复较慢。脑与体pH差异（ΔpH=脑pH–体pH）的时间行为如图1A中间面板所示。值得注意的是，窒息期间脑相对于体pH的缓慢碱性偏移发展，在90分钟恢复期结束时未完全消退。

图1 P6大鼠在实验性窒息、高碳酸血症和缺氧条件下诱导的pH反应。(A)大脑（红色）与躯体（蓝色）对45分钟5%氧气窒息的pH反应（上图）、两者差异（中图）以及血脑屏障电位 VBBB 值（下图）。本图及后续图表中，叠加的细线与粗线分别表示单个记录数据及其均值。数据轨迹上方的折线图标明了动物暴露于不同气体的时间点。灰色阴影用于突出显示大脑与躯体pH值的差异，排除了因吸入二氧化碳浓度变化导致的呼吸性躯体pH反应缓慢引起的短暂波动。(B)由20%二氧化碳诱导的45分钟高碳酸血症引发的反应。(C)通过将吸入气体中的氧气含量降至5%诱导的45分钟缺氧反应。本图及后续图表中部分单个记录轨迹未持续至恢复阶段结束（因记录中断），这解释了均值轨迹中出现的小幅阶梯式变化。

3.1.2 高碳酸血症


20%CO₂诱导的高碳酸血症引起脑pH快速下降，最大速率（每分钟0.21±0.03pH单位）和幅度（10分钟时0.45±0.01；n=6；P=0.294；图1B）与窒息中观察到的相似。然而，与窒息不同，没有进一步的缓慢酸中毒，而是在高碳酸血症17.6±1.5分钟时达到峰值酸中毒6.85±0.01后，出现0.03pH单位的小但一致的上升（45分钟时最终pH6.89±0.02）。与窒息相反，高碳酸血症导致体pH下降，达到的稳定最大幅度与同时脑中产生的几乎相同（45分钟时分别为0.48±0.02，n=6 vs 0.43±0.02；P=0.099，配对t检验；45分钟时最终体pH6.84±0.04）。值得注意的是，这种pH变化与CO₂从5%增加到20%在无非其他缓冲液的生理CO₂/碳酸氢盐溶液中产生的0.6pH单位的"被动"（即纯物理化学）酸偏移非常相似。这表明实验性窒息期间构成脑酸中毒主要部分的脑pH快速下降，主要由CO₂在脑细胞外空间的增加引起，其中非CO₂缓冲能力低。脑与体pH的更快反应（见图1中ΔpH迹线的瞬态"开启"和"关闭"反应）很容易通过与皮下体pH测量部位相比脑组织更有效的灌注来解释。


因此，在比较新生儿对窒息和高碳酸血症的体pH反应时，观察到了显著且生理学相关的差异。特别是，上述数据表明实验性窒息触发了代谢性酸中毒，其在体内远大于在脑内。


虽然与实验性窒息期间的代谢性酸中毒一致，但上述动态pH数据为其产生提供了间接证据。因此，我们从P6大鼠采集血样，确实发现目前的窒息方案仅在15分钟内就将血乳酸从对照的0.88±0.15mmol/L升高到11.1±0.80mmol/L。鉴于乳酸的产生在很大程度上是造成碱缺失（负碱剩余）的原因，而碱缺失是BA的关键诊断标准之一，这一结果具有进一步的（转化）重要性。


3.1.3 缺氧


总体而言，上述数据表明一种内源性机制在窒息期间保护脑免受代谢性酸中毒和碱缺失。这一观点从同时测量的脑和体pH对缺氧（5%O₂；图1C）的反应中获得了进一步支持。出乎意料的是，与窒息期间观察到的形成鲜明对比，脑pH测量显示缺氧引起碱性偏移。脑pH在16±1.5分钟时达到最大增加0.13（7.44±0.01 vs基线，n=5；P=0.0003，配对t检验），虽然幅度减小，但在整个45分钟缺氧期间保持高于对照（5次记录中5次）。恢复至空气引起短暂的反跳性酸中毒，随后脑pH恢复至对照水平。碱性pH反应表明缺氧触发酸当量跨血脑屏障（BBB）的净排出速率超过脑内净酸产生速率。


在缺氧期间体pH的测量中也看到了BBB水平的有效区室化，其中观察到逐渐的单相酸化（45分钟时幅度0.18±0.04，n=5），无初始碱中毒。这让人想起窒息期间缓慢（显然是代谢性的，见上文）体酸中毒的动态。总之，这些反应导致在整个缺氧期间持续的稳健正ΔpH偏移（图1C）。类似的长时间正ΔpH偏移也由窒息引起，但高碳酸血症未引起（见图1中的阴影区域，表示缓慢产生的正（脑更碱性）ΔpH，其中吸入CO₂阶跃变化引起的ΔpH瞬态已被扣除）。


基于图1数据的最终结论是，与窒息相关的脑和体pH变化的时间进程和幅度（图1A）大致表现为两个潜在组成部分——高碳酸血症（图1B）和缺氧（图1C）触发的pH反应的总和。


3.2 跨BBB的pH诱导变化


BBB维持脑组织与身体其余部分之间的pH敏感电位差（V_BBB）。我们监测V_BBB信号，通过测量脑与体之间的电压变化（见材料与方法）。窒息或高碳酸血症诱导的酸偏移如预期般伴随着V_BBB的正偏移，最大幅度分别为7.1±0.18mV（n=6）和4.9±0.49mV（n=6）（P=0.0015）。缺氧时V_BBB的反应为正，与其较小的幅度和时间进程一起，表明其依赖于体pH而非脑pH。先前的工作表明，呼吸诱导的毫伏级慢脑电图偏移由人类BBB产生，可以使用直流耦合脑电图进行非侵入性测量。因此，测量直流-脑电图偏移可能为BA恢复期间的脑监测开辟新窗口（见讨论）。


3.3 窒息后脑和体PO₂变化


上述结果提出了关于实验操作期间脑与体氧可利用性和消耗的问题。由于CO₂是众所周知的血管扩张剂，我们接下来对P6大鼠进行了组织记录。


P6大鼠所有实验中脑和体PO₂的基线平均水平分别为20.8±0.9mmHg（n=54）和26.0±1.8mmHg（n=23）。这些水平远低于（a）吸入空气中的PO₂，约为160mmHg，以及（b）动脉血PO₂90至100mmHg，对应于正常的96%至98%氧饱和度，与反映O₂输送和消耗之间平衡的组织PO₂水平一致。


脑和体PO₂对窒息、高碳酸血症和缺氧的反应在支持信息中详细说明和描述。主要发现如下：窒息（5%O₂/20%CO₂）使脑和体PO₂均瞬间降至接近零（见材料与方法），窒息后恢复伴随大的短暂过冲。高碳酸血症（20%CO₂）期间，脑和体PO₂分别增加3.6倍和2.7倍。毫不奇怪，纯5%O₂缺氧期间脑PO₂处于接近零水平，甚至更中度的9%O₂缺氧也使脑和体PO₂迅速下降并保持在接近零水平。我们的数据表明，在5%O₂窒息和5%至9%O₂缺氧期间，脑消耗所有可利用的O₂，但就此而言，脑实质内接近零的O₂水平并不能证明在这些条件下脑能量代谢主要是无氧的结论。此外，我们的结果提出了一个问题：当窒息期间脑保留机制活跃时，需要多少O₂才能避免严重组织缺氧？为解决这些问题并推进实验的转化潜力，我们接下来使用间歇性窒息方案记录了pH和PO₂反应。