1 材料与方法


1.1 伦理批准


所有实验程序均按照欧洲保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物公约（ETS123）和2010/63/EU指令进行，在芬兰以2013年第497号法案和2013年第564号法令实施，关于保护用于科学或教育目的的动物。所有实验均经赫尔辛基大学当地动物伦理委员会和国家动物伦理委员会批准。


1.2 动物


实验在P6（n=96）或P11（n=43）的雄性Wistar大鼠，或P0至P2的任一性别豚鼠（n=5）上进行。由于未使用同一只动物多次测试任何反应，n表示实验数量以及动物数量。大鼠在实验前立即从赫尔辛基大学实验动物中心（LAC）控制的内部动物设施获得，大鼠饲养在12小时光/暗周期的笼中，自由进食和饮水。豚鼠在类似的条件下饲养在LAC设施中，在麻醉手术前不超过30分钟从那里获得。


1.3 手术和准备


动物用4%异氟烷在空气中麻醉，腹腔注射1mg/g乌拉坦，手术期间异氟烷降至1.5–2%。去除头皮皮肤和软组织后，为电极植入进行开颅，包括：（1）海马上方开颅用于pH（两个0.9mm对侧孔）和PO₂（一个0.9mm孔）记录；（2）枕骨开颅用于接地线（放置在小脑上方）。用细针轻轻打开暴露的硬脑膜以允许电极植入。在下背部做皮肤切口用于皮下放置体pH和PO₂记录。手术结束时，额外注射0.5mg/g乌拉坦并完全去除异氟烷。如果在传感器放置期间动物对尾夹有反应，在开始实验前额外注射乌拉坦（0.5mg/g）。


手术后，动物放置在实验装置中的加热垫上，头部固定于立体定位装置。体温通过直肠探头和BAT‑12温度计（Physitemp，美国新泽西州）控制，调整加热以在大鼠基线记录期间将体温维持在典型的治疗性低温水平33.5–34.0°C，以避免缺氧和窒息期间的死亡率。在豚鼠实验中，加热设置保持与用于大鼠的相似。压电运动传感器（PMS20S，Medifactory，荷兰海尔伦）用胶带固定在胸部下部以记录呼吸节律。


1.4 微传感器


使用商用H⁺敏感玻璃膜pH微电极，型号pH‑25和pH‑500，以及Clark型极谱O₂微传感器，型号OX‑10和OX‑N（Unisense A/S，丹麦优尼森）分别用于脑和体的pH和PO₂记录。传感器尖端直径为：脑PO₂ 10μm，脑pH 25μm，体pH和PO₂ 500–750μm。尖端断裂至约20μm外径并填充0.9%NaCl的玻璃毛细管微吸管用作pH记录的参比电极。脑和体pH信号及其参比电极信号使用定制静电计放大器和细胞外场电位放大器（EXT‑02F/2，npi electronic GmbH，德国塔姆）记录。脑和体PO₂信号使用PA2000皮安计（Unisense A/S，丹麦奥胡斯）记录。信号经抗混叠滤波并使用Micro1401‑3转换器（CED，英国剑桥）数字化，呼吸采样频率为100Hz，pH、PO₂和温度为10Hz，使用Spike2软件记录在硬盘上。血脑屏障电位（V_BBB）测量为脑和体参比电极之间的差异。


脑探针植入的坐标为P6和P11大鼠前囟后3–3.5mm、外侧3–4mm、深度2.5–3mm，豚鼠前囟后5mm、外侧6mm、深度3.5mm。脑pH记录的参比电极始终位于pH微电极的对侧，在有同时脑PO₂和pH记录的动物中位于脑PO₂微传感器的同侧。体pH、PO₂和参比电极皮下放置，尖端从皮肤切口推进至少10mm。皮肤切口用硅脂覆盖以防止空气进入记录部位。


1.5 校准


所有使用的pH和PO₂传感器在每次实验前后进行校准。pH电极用其参比电极使用两种含150mmol/L NaCl和20mmol/L HEPES的溶液进行校准，pH用NaOH调整至6.8和7.8。校准溶液的精确pH值定期用标准实验室pH计检查。O₂传感器使用标准细胞外溶液校准，用两种气体混合物鼓泡至少30分钟，一种含0%O₂（N₂中5%CO₂），另一种含5或9%O₂和N₂中5–20%CO₂。所有校准在室温下进行，数据分析期间应用温度校正。


由于pH校准在室温下进行，差分pH记录的温度敏感性通过实验确定，不忘校准溶液中使用的HEPES的pKa的温度依赖性。基于结果，对组织pH值应用‑0.09pH单位的校正。队列中个体之间观察到的脑或体pH基线值的差异反映了pH的真实差异以及该方法特有的随机误差来源。后者可能占主导，因此个别记录的基线偏移至相应均值。


极谱O₂微传感器的信号和气态O₂的溶解度具有温度依赖性。因此，为了以分压为单位量化数据，我们使用在室温（20–21°C）和34°C下用含0%、5%或9%O₂的气体混合物剧烈鼓泡至少半小时的溶液分析了这些温度依赖性的总体效应，发现温度依赖性约为每°C 1%。脑和体PO₂传感器数据在数据分析期间相应校正。在非常低的组织PO₂值（传感器电流接近0pA）时，通常发生在5%缺氧或窒息期间，PO₂迹线仍在波动或稳定显示无波动持续数分钟。在发生后一种情况的实验中，非波动水平被视为"真零"，并相应偏移PO₂迹线。这种平均偏移脑和体PO₂分别为1.5mmHg和2.5mmHg，并应用于实验中未看到真零条件的迹线。


1.6 实验方案


记录信号初始稳定后，从每只动物记录30分钟基线，动物通过小型啮齿动物面罩（大鼠型号OC‑MFM，豚鼠型号OC‑LFM，World Precision Instruments）呼吸加湿室温空气，流速约为1200ml/min。加湿实验气体混合物（AGA [Linde Group]，芬兰）以相同流速应用，具体如下：N₂中5%或9%O₂和20%CO₂（窒息）；N₂中5%或9%O₂（缺氧）；N₂中5%、10%或20%CO₂和20–21%O₂（高碳酸血症；前两种也用于GRN）。为清晰起见，气体应用的时间在图中给出。


1.7 乳酸测量


血乳酸使用GEM Premier 4000血气分析仪（Instrumentation Laboratory）测量。P6大鼠暴露于5%窒息15分钟，之后立即采集和分析血液。


1.8 数据分析


数据使用Matlab（MathWorks Inc.）中的定制脚本，以及Excel（Microsoft）和SigmaPlot 14（Systat Software, Inc.）处理。


所有数值数据以均值±标准误给出（包括pH，它是质子活性的对数测量；见支持信息）。均值之间的差异使用非配对或配对t检验评估，如未指定则检验为非配对。P<0.05被视为具有统计学显著性。我们意识到当样本量较小时t检验的局限性，我们仅将P值作为提示性信息给出。读者可能会欣赏原始数据的低变异性，这在结果中很明显。