摘要


目的： 本研究旨在开发一种能够在复杂生物体液（如血清、唾液）中，对小分子生物标志物（如神经递质、激素）进行快速、精准、抗干扰定量检测的新型电化学传感平台，以克服传统免疫分析法灵敏度低、操作繁琐以及现有适配体传感器在复杂基质中易受生物污损和非特异性吸附影响的局限。


研究过程： 研究团队设计并构建了一个基于双通道交错微电极阵列的适配体传感平台。首先，通过荧光淬灭与恢复实验，系统优化了互补DNA和捕获探针的序列，确保了靶标结合时的高效信号置换。随后，利用微加工技术在玻璃基底上制备了精密交错电极。通过选择性电化学解吸技术，在两个工作电极上分别构建了不同的功能层：一个电极修饰了与氧化还原标记探针杂交的适配体（信号关闭模式），另一个电极则固定了捕获探针（信号开启模式）。为实现快速检测，研究引入了电场辅助扩散策略，通过施加短暂正偏压加速探针迁移。


解决问题： 该平台通过“释放-捕获”的双通道信号转换机制，有效抵消了由基质效应引起的基线漂移和非特异性背景噪声，显著提升了检测的信噪比和准确性。同时，电场辅助策略将传统耗时的扩散过程大幅缩短，解决了即时检验场景下对检测速度的要求。

图1： 用于在交错电极阵列芯片上进行小分子检测的电化学双通道适配体传感平台。(a) 传感器平台示意图，包含两个交错工作电极（WE1和WE2），设计用于在靶标识别时产生相反的电化学响应。(b) 传感机理：WE1以信号关闭模式工作，靶标结合触发亚甲基蓝标记的互补DNA释放。释放的MB-cDNA随后被固定在WE2上的捕获探针重新捕获，产生信号开启响应。6-巯基-1-己醇作为回填分子，优化表面固定DNA的密度。(c) 玻璃基底上IDE芯片的照片。(d, e) 在人工脑脊液中无靶标（仅缓冲液）和有靶标（100 nM多巴胺）条件下，WE1(d)和WE2(e)的时间依赖电流响应。电流数据通过方波伏安法测量，峰值使用PSTrace软件提取。数据表示为平均值±标准差。(d)中n=4–5个独立工作电极；(e)中n=3个独立工作电极。

图2： IDE芯片的功能化及选择性自组装单层去除以实现双通道传感。(a) 传感策略示意图：在WE1上固定与MB-cDNA杂交的硫醇锚定适配体。靶标结合后，cDNA释放并被WE2上的捕获探针重新捕获，实现双信号输出。(b) 逐步功能化后工作电极的循环伏安表征。(c) 基于与1 µM MB-cDNA杂交后的SWV峰电流优化适配体浓度（1–5 µM）。根据最大电流响应，选择2 µM用于后续实验。(d) 左图：裸电极与功能化电极的CV峰电流对比，显示由于SAM形成导致的电流下降。右图：在−1.1 V电位下不同时长电化学去除WE2上SAM的优化。峰电流随去除时间增加而增大，约250秒后饱和。(e) 使用SYBR Gold染色（一种与DNA结合后荧光显著增强的花青染料）在SAM去除前后的荧光图像，证明WE2上DNA功能化SAM被选择性去除。(f) 在无和有100 nM多巴胺条件下，WE1（上）和WE2（下）的SWV响应，显示WE1的信号关闭行为和WE2因靶标诱导cDNA置换和再捕获而产生的信号开启行为（见插图示意）。(c)和(d)中数据表示为平均值±标准差，(c)n=5，(d)左n=5、右n=3。采用非配对双样本t检验进行统计分析；裸电极与功能化电极之间的CV峰电流差异显著（***p < 0.0001）。(b)和(d)中的CV测量在含有100 mM KCl和5 mM [Fe(CN)₆]⁴⁻/[Fe(CN)₆]³⁻ (1:1)的PBS中进行。


结论： 该双通道适配体传感平台在人工脑脊液中对多巴胺的检测限低至3纳摩尔，并展现出优异的选择性。通过电场辅助，检测时间可缩短至5分钟以内。该平台成功拓展至皮质醇的检测，并在未经繁琐预处理的稀释人血清和唾液中均实现了可靠定量，验证了其在多种复杂生物介质中的通用性与应用潜力，为下一代即时诊断设备的发展提供了新的技术路径。


结论


本研究开创性地提出并验证了一种基于空间分离式交错微电极的双通道电化学适配体传感新范式。该平台的核心创新在于其精巧的“信号释放-再捕获”机制：当靶标小分子与第一工作电极上的适配体结合后，会触发带有氧化还原标记的互补DNA链的释放；这些释放的探针随即被第二工作电极上的捕获探针高效回收，从而在同一芯片上实现了“信号关闭”与“信号开启”两种互补模式的同步输出。这种双通道逻辑设计巧妙地消除了复杂生物基质带来的非特异性干扰和基线漂移，从根本上提升了检测的鲁棒性与准确性。此外，研究团队通过引入电场辅助扩散策略，利用微弱的正偏压加速了带电探针的定向迁移，将原本需要数小时的孵育过程压缩至短短几分钟，完美契合了即时检验对检测速度的严苛要求。凭借在人工脑脊液中对多巴胺达到纳摩尔级的灵敏度、对结构类似物的出色区分能力，以及在稀释血清和唾液中成功检测皮质醇的实例，该平台充分展示了其作为通用型小分子分析工具的广阔前景。尽管在面对极高浓度蛋白的未稀释样本时仍面临挑战，但这一工作无疑为构建下一代能够实现连续、实时、活体监测的可穿戴或植入式生化传感器奠定了坚实的技术基础，预示着在个性化医疗和疾病动态管理领域将有重要的应用价值。