氧测量和发光分析

图4 分离髓磷脂的氧测量和发光分析

a板显示对不同年龄大鼠IM进行的氧测量分析结果。从左至右：成年，成年大鼠IM；p5，出生后5天大鼠IM；p7，出生后7天大鼠IM；p11，出生后11天大鼠IM；p14，出生后14天大鼠IM；p33，出生后33天大鼠IM。氧消耗以nmol O/min/mg表示。b板显示对不同年龄大鼠IM进行的发光分析结果。样本顺序与a相同。ATP产生以nmol/min/mg表示。每板代表至少五次实验。对于两板，数据以均值±标准差表示，表示与成年大鼠（p90）值相比p<0.001。


对不同年龄大鼠分离髓磷脂（IM）进行氧测量和发光分析，以了解氧化磷酸化机制何时开始能够产生ATP。图4a显示，仅在大鼠p14、p33和p90的IM中可检测到氧消耗。此外，p33和p90大鼠的IM即使在无底物的情况下也消耗氧气。向样本中加入NADH增加了氧消耗，这是由于复合体I–III–IV通路的刺激。加入ADP后呼吸进一步增加，表明电子传递链与ATP合酶之间存在偶联。IM中的ATP产生（图4b）从p5开始可检测到，随大鼠年龄增加。鉴于氧消耗仅在出生后第14天后可检测到，可以推测p5和p7大鼠的ATP产生可能源于无氧糖酵解过程。p11的IM显示ATP产生增加三倍，与ATP合酶表达的出现相对应（图1和图2）。p11时氧消耗不可检测的事实也可能取决于氧测量技术相对于发光技术的较低灵敏度。p14和p33大鼠IM的ATP合成遵循氧消耗的趋势，在p90时趋于稳定，表明正确形成的髓鞘能够执行氧化磷酸化，如先前报道。


髓鞘形成过程中高尔基体、内质网和线粒体融合标记物的表达


评估了髓鞘形成过程中反式高尔基体囊泡标记物Giantin和内质网（ER）标记物Calnexin的表达。图5a显示，两种信号在大鼠脑匀浆中从p5到p14增加，然后在p33和p90稳定，表明这些结构在髓鞘形成期间显著发育，并提示其在膜融合过程中的积极作用。密度分析证实了数据（图5b）。此外，为评估线粒体动态，分析了负责线粒体融合的线粒体动力相关GTP酶OPA1的表达。如图5a、b所示，信号从p5到p11增加，在p33达到最大值，然后在p90稳定。

图5 髓鞘形成过程中高尔基体和内质网表达的评估

a板显示样本（p90，成年大鼠脑匀浆；p5-33，出生后5至33天大鼠脑匀浆）经考马斯亮蓝胶体蓝染色的蛋白质图谱。b板显示对不同年龄大鼠脑匀浆进行的针对Giantin、Calnexin和OPA1的半定量蛋白质印迹。p90，成年大鼠脑匀浆；p5，出生后5天大鼠脑匀浆；p7，出生后7天大鼠脑匀浆；p11，出生后11天大鼠脑匀浆；p14，出生后14天大鼠脑匀浆；p33，出生后33天大鼠脑匀浆。这些信号的密度分析比值如c所示。密度分析值以相对光密度（R.O.D.）的均值±标准差表示，经考马斯亮蓝胶体蓝染色的蛋白质图谱归一化。每板代表至少五次实验。


讨论


本研究旨在支持我们的假说，即线粒体氧化磷酸化机制嵌入于包括髓磷脂在内的其他膜中。鉴于五个氧化还原复合体是髓鞘的真正组分，正如许多蛋白质组学分析所提示，髓鞘形成与它们在髓磷脂中出现之间的时间关系应该相同。为此，在出生后第一个月发生髓鞘形成的啮齿动物模型中追踪了髓鞘形成，该动物出生时完全无髓鞘。考虑到髓磷脂在出生后5–6天开始发育，在出生后约第14天加速，约4周完成，大鼠在出生后第5、7、11、14和33天被处死。


氧化磷酸化的线粒体机制似乎从线粒体转移到髓鞘。事实上，数据显示分离的髓磷脂在髓鞘形成期间开始表现出氧化磷酸化组分。有趣的是，ND4L和ATP的表达增加与髓鞘形成平行，正如文献已报道。然而，线粒体数量似乎减少，正如针对脑匀浆中TIM的蛋白质印迹分析所提示。因此，可以推测只有氧化磷酸化机制，而非整个线粒体，可能被转移到其他细胞膜。值得注意的是，电子传递链和ATP合酶据报道被组织在称为超复合体的超分子结构中。可以推测超复合体在线粒体内组装，并可能通过内质网和高尔基体的参与整体转移到髓鞘，因为这是将内在膜蛋白转移到质膜的主要生理机制。事实上，髓磷脂含有一些由线粒体DNA编码的氧化磷酸化亚基，例如复合体I的亚基ND4L，证实了髓磷脂中的呼吸机制与线粒体中描述的相同。这也与线粒体是动态细胞器的概念一致，它们能够与其他细胞膜通讯以维持细胞稳态、生物能量学和存活。


氧测量和发光分析显示，髓磷脂在出生后第14天后获得执行完整氧化磷酸化的能力。特别是，p33大鼠髓磷脂的活性与成年大鼠（p90）观察到的相似，表明氧化磷酸化机制在髓鞘形成过程结束时准备好产生化学能。氧化磷酸化活性相对于ATP合酶和电子传递链表达的出现略有延迟（见表4），提示脂质环境及其组织也可能至关重要。这已被观察到。心磷脂（一种与复合体III和IV相关的双磷脂）的改变诱导氧化磷酸化损伤，伴随氧化应激增加。我们最近的工作已证明，改变的髓磷脂降低其ATP合成能力并增加氧化应激产生。我们先前报道，以改变稳定性为特征的CMT1A大鼠的髓磷脂失去其代谢功能。有趣的是，对不同年龄中枢神经系统60分钟氧/葡萄糖剥夺后功能丧失的研究表明，白质显示出显著的能量储备。特别是，前髓鞘化视神经（p0–p4）表现出对缺血的相当大的抵抗力，而早期髓鞘化阶段（p5–p20）仅部分耐受。


髓磷脂生物发生是脑发育中的基本步骤。当少突胶质细胞进入终末分化且髓磷脂基因表达开始时，其突起与轴突相互作用，髓鞘形成开始。在此阶段，少突胶质细胞内的膜转运急剧增加，推测可能也是为了将髓磷脂组分转移到其靶膜。有趣的是，我们观察到Calnexin和Giantin表达的增加，分别为内质网和高尔基体的标记物（图5）。内体循环在蛋白质分选和转运中发挥核心作用，作为从高尔基体网络到质膜的货物转运过程中的中间步骤。在斑马鱼中，编码内质网转位酶装置蛋白的SEC63基因突变导致中枢和外周神经系统髓鞘形成减少以及少突胶质细胞内质网肿胀。考虑到线粒体与内质网之间通过线粒体相关膜（MAMs）的相互作用已被描述，且其组分与其他细胞膜结构融合，可以假设内质网和高尔基体可能参与氧化磷酸化机制从线粒体到髓鞘的转移。事实上，质膜和高尔基体是髓鞘形成期间最活跃的细胞区室。


涉及线粒体融合蛋白突变的几种线粒体疾病，如Leber遗传性视神经病变、Friedreich共济失调、Charcot-Marie-Tooth 2a和显性视神经萎缩，常伴随脱髓鞘。Cortopassi等人报道，在五种与脱髓鞘相关的线粒体遗传疾病中，多种参与髓鞘化的转录本显著下调。在多发性硬化症中，脱髓鞘轴突增加线粒体数量，显然是对能量需求变化的反应。此外，关于消失性白质病（VWM）的一篇最新论文描述了线粒体氧化功能障碍的失调和活性氧产生的增加。作者假设改变的线粒体功能可能影响髓鞘的能量功能，证实了线粒体与髓磷脂之间可能的联系。特别是，作者指出："髓鞘可能的能量作用可以解释慢性脱髓鞘轴突的退化，并提示VWM疾病可能源于髓鞘能量供应的功能障碍"。


总之，本数据提示氧化磷酸化蛋白被设计为在髓鞘形成期间成为新生鞘的功能性部分，一旦髓磷脂发育完成，氧化磷酸化即被激活。数据与内质网和高尔基体参与这一过程的假说不矛盾。


致谢


本研究获得Giuseppe Levi基金会-国家林琴科学院资助，研究项目题为"髓磷脂线粒体外ATP产生：呼吸链复合体的定位及其在多发性硬化症轴突退化中的可能作用"；以及Compagnia di San Paolo基金会-神经科学计划资助，研究项目题为"髓鞘化轴突的能量代谢：髓鞘的新营养作用"。