研究简介:类风湿性关节炎（RA）是一种慢性炎症性疾病，主要影响关节，导致局部炎症、骨质侵蚀，甚至关节畸形，影响全球约0.5-1.0%的人口，严重影响患者的生活质量。尽管RA的发病机制尚不完全清楚，科学家们认为它起源于身体免疫系统对关节的损伤。因此调节局部免疫微环境是RA治疗的主要目标。因此开发一种既能抗炎又能促进关节修复的治疗平台具有重要意义。临床上非甾体抗炎药（如阿司匹林和依托考昔）和糖皮质激素（如地塞米松）已被用于减轻炎症以治疗RA。然而这些药物可能会引起严重的不良反应，如胃肠道出血和骨质疏松等，限制了RA治疗的疗效。


开发一种有效且生物相容的RA治疗平台，以实现抗炎和关节修复的全面目标，具有很高的临床需求。本研究通过简单的水相剥离法制备了二维层状钙硅化合物纳米片（CSNs）。这些CSNs在水解时会产生抗氧化的H₂、碱性的Ca(OH)₂和硅酸。这些产物在抗氧化、抗炎和促进成骨方面发挥重要作用。

研究者们通过一系列实验验证了CSNs的这些特性，并在体外和体内模型中评估了它们的治疗效果。CSNs通过超声辅助液相剥离法制备，具有良好的分散性和稳定性。透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）表征显示，CSNs具有均匀的尺寸和锐利的边缘，厚度在0.5到1.5纳米之间。X射线衍射（XRD）和选区电子衍射（SAED）确认了CSNs的晶体结构。本研究成功开发了一种新型的二维纳米材料——CSNs，它们通过水解产生多种有益的治疗产物，为RA的治疗提供了一种新的策略。CSNs不仅能够减轻炎症，还能促进骨微环境的成骨重塑，这对于RA的全面治疗具有重要意义。此外，CSNs在体内实验中显示出良好的生物相容性和治疗效果，具有临床转化的潜力。


Unisense微电极分析系统的应用


Unisense微电极被用于检测CSNs（钙硅化合物纳米片）在不同pH值条件下水解产生的氢气量。Unisense氢气电极探针来实时记录CSNs与水反应产生的氢气量。实验在不同pH值（6.5、7.4和8.5）的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中进行，结果显示CSNs在酸性条件下（pH 6.5）产生氢气的量最多，为146.8 μmol L⁻¹，而在中性（pH 7.4）和碱性（pH 8.5）条件下产生的氢气量分别为31.1 μmol L⁻¹和13.6 μmol L⁻¹。研究人员利用Unisense微电极检测到的氢气产生量，间接证明了CSNs具有抗氧化性能。因为氢气是一种有效的抗氧化剂，能够清除羟基自由基，从而在RA治疗中发挥抗氧化作用。


实验结论


开发了一种新型的二维纳米材料——钙硅化合物纳米片（CSNs），它们通过水解产生多种有益的治疗产物，为类风湿性关节炎（RA）的治疗提供了一种新的策略。通过简单的水相剥离法制备了二维层状钙硅化合物纳米片（CSNs），这些纳米片具有良好的分散性和稳定性。CSNs在水解时产生抗氧化的H₂、碱性的Ca(OH)₂和硅酸，这些产物在抗氧化、抗炎和促进成骨方面发挥重要作用。CSNs显示出良好的生物相容性，并且能够通过产生H₂有效清除细胞内的活性氧（ROS），从而减轻炎症。CSNs能促进巨噬细胞从促炎的M1表型向抗炎的M2表型转变，减少炎症因子的释放。CSNs能够促进成骨细胞的分化和抑制破骨细胞的活性，这对于RA的治疗至关重要。CSNs通过水解产生的H₂和Ca(OH)₂，有效中和了RA关节中的酸性微环境，抑制了破骨细胞的活性。CSNs可以清除过量的活性氧（ROS），恢复了炎症平衡，抑制了NF-κB和MAPK信号通路的过度激活，从而减少了炎症因子的产生。促进成骨细胞的分化和抑制破骨细胞的活性，促进了骨微环境的修复。

图 1、通过抗炎、抗破骨作用和促成骨作用的水解二硅酸钙纳米片逆转类风湿性关节炎的示意图。

图 2、CSN 的制备和表征。a） 通过超声辅助剥离由块状二硅化钙 （BCS） 制成的 CSN 的示意图。b） BCS 的 SEM 图像。比例尺：500 nm。c） 具有均匀大小的 CSN 的 TEM 图像。比例尺：500 nm。插图：单个 CSN 的 TEM 图像。比例尺：50 nm。d） CSN 的横向尺寸分布。插图：分散在乙醇中的 CSN 的数码照片，具有 Tyndall 效应。e） AFM 图像和 f） CSN 的相应厚度分布。比例尺：400 nm。g） BCS 和 CSN 的 XRD 图谱，参考标准衍射图谱 PDF：97-019-35。h） 高分辨率 TEM 图像和 i） CSN 的相应晶格条纹分析。比例尺：5 nm。j） CSN 的选定区域电子衍射图样。比例尺：5 nm。k） CSN 的高角度环形暗场图像和相应的元素映射。

图 3、CSN 的水解评估 a） CSN 水解反应产物的示意图 b） CSN 在不同 pH 值下与 HO 反应产生的氢气的照片和定量测量。c） 在 Fe （20 μm） 和 H O （2.5 mm） 存在下对 CSN 进行电子自旋共振分析。d） CSNs 水解过程中的时间依赖性 Ca 释放。e） 在不同条件下反应 6 小时的 pH 值：pH 6.5、7.4 和 8.5、去离子水（pH 6.5、7.4 和 8.5）、SBF（pH 6.5、7.4 和 8.5）和 PBS（pH 6.5、7.4 和 8.5）。f） TEM 图像，g） 元素映射和相应的 h） 6 小时后 PBS 中水解过程中 CSN 的 EDS 曲线（位点 1：CaSinano 片;站点 2：Ca （PO ））。i） TEM 图像中指示站点（站点 1 或站点 2）的 SAED 模式。

图 4、CSN 的体外抗氧化、抗炎和骨骼调节。a） ROS 探针 DCFH-DA 的细胞内传感机制示意图。b） 不同处理后用 DCFH-DA 染色的 RAW 264.7 细胞的共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 图像。比例尺：25 μm。c） CSN 从 M1 表型到 M2 表型的巨噬细胞复极化示意图。d） 用 Actin-Tracker Red-555 染色的 RAW 264.7 细胞的 CLSM 图像。e） 流式细胞术分析和 f） 不同处理后对 RAW 264.7 细胞染色的抗 CD86 和抗 CD206 抗体的相应定量分析。数据表示为 SD ±均值 （N = 3）。g） 不同处理后 RAW 264.7 细胞的 IL-1β、IL-6、IL-10 和 TGF-β 的蛋白质定量。数据表示为 SD ±均值 （N = 3）。h） ALP 染色和 i） 使用指定处理对 MC3T3 细胞进行相应的定量分析。数据表示为 SD ±均值 （N = 3）。j） 指定处理后 MC3T3 细胞的茜素红 S 染色和 k） 相应的定量分析。数据表示为 SD ±均值 （N = 3）。l） 指定处理后 RAW264.7 细胞的 TRAP 染色和 m） 相应的定量分析。数据表示为 SD ±均值 （N = 3）。

图 5、巨噬细胞复极化的机制研究。a） 接受不同处理的 RAW 264.7 细胞的 RNA 测序分析示意图。该图由 Figdraw 创建。b） 来自不同群体的 RAW 264.7 细胞基因的 PCA 分析。数据按原样显示 （N = 3）。c） 来自不同组的 RAW 264.7 细胞转录组中差异表达基因的基因聚集。数据按原样显示，并按平均值显示 （N = 3）。d） 来自不同组的 RAW 264.7 细胞的炎症相关途径中涉及的 DEGs 的热图分布。数据按原样显示 （N = 3）。e） LPS/IFN-γ 和 LPS/IFN-γ + CSN 处理的 RAW 264.7 细胞转录组中 DEGs 的火山图。f） LPS/IFN-γ 和 LPS/IFN-γ + CSN 处理细胞的前 15 个 DEGs 的相互作用。g） LPS/IFN-γ 和 LPS/IFN-γ + CSN 处理细胞的 KEGG 富集分析气泡图 h） Nfkb2 的 mRNA 表达， 来自不同组的 RAW 264.7 细胞的 Mapk12 和 Tnf。数据表示为 SD ±均值 （N = 3）。i） IL-17 信号通路的 GSEA 图显示，用 LPS/IFN-γ 处理的 RAW 264.7 细胞 CSN 处理后显着下调 （NES = -1.74）。j） CSN 巨噬细胞复极化的分子机制示意图。k） 来自不同组的 RAW 264.7 细胞的 p65、p38 和 FosB 的蛋白质印迹分析。


结论与展望


类风湿性关节炎（RA）是一种慢性炎症性疾病，影响关节，导致局部炎症、骨质侵蚀和关节畸形。目前的治疗方法主要集中在减轻炎症，但没有考虑到促进骨微环境的成骨重塑。在本研究中，研究人员通过简单的水相剥离法制备了二维层状钙硅化物纳米颗粒（CSNs）。CSNs的水解可以产生抗氧化的H₂、碱性的Ca(OH)₂和硅酸。这些成分在抗氧化、抗炎和促进成骨方面发挥重要作用，从而显著改善RA的治疗效果，优于单纯的抗炎治疗。氢气被证实可以清除过量的羟基自由基并调节巨噬细胞的再极化；生成的Ca(OH)₂可以中和酸性微环境并抑制破骨细胞活性；而溶解的Ca²⁺可以与磷酸根离子有效结合，形成磷酸钙，促进关节的成骨。CSNs的多功能性能在关节炎小鼠和兔子模型中得到了进一步验证，提供了一种针对RA的先进且稳健的治疗策略，具有高生物相容性和临床转化潜力。Unisense微电极通过精确测量CSNs水解产生的氢气量，为研究CSNs的抗氧化和抗炎机制提供了重要数据支持。这些数据帮助研究人员理解CSNs在不同生理环境下（如酸性炎症环境）的活性，以及它们如何通过产生氢气来中和自由基，减轻炎症反应，从而为RA的治疗提供了一种新的策略。