脑切片的共聚焦显微镜分析


不同年龄大鼠的脑被分离并固定在4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中12小时。之后，样本用PBS冲洗、脱水并包埋在Paraplast中。切割5 μm厚的横向石蜡切片，在递减乙醇系列中复水，并用PBS洗涤。根据间接免疫荧光方法，进行双重免疫组织化学染色。首先，脱蜡连续切片在4°C湿润箱中与抗F₀F₁ ATP合酶β亚基兔多克隆抗体（1:400）稀释于PBS中孵育过夜。然后，PBS洗涤后，切片与Alexa-488偶联抗兔抗血清（1:800）孵育1小时。随后，切片与抗MBP小鼠单克隆抗体（1:1000）和Alexa-633偶联抗小鼠二抗（1:800）孵育过夜。然后，切片用PBS洗涤，用DAPI作为核染料染色，并包埋在甘油/PBS（1:1）溶液中。免疫荧光共聚焦激光扫描显微镜成像在倒置Leica TCS SP5 AOBS共聚焦激光扫描显微镜（Leica Microsystems CMS，德国曼海姆）上进行。在这些样本上于18°C进行共聚焦荧光成像。


氧消耗测量


氧消耗在配备安培电极（Unisense–Microrespiration，Unisense A/S，丹麦）的恒温氧测量仪中测定。每份样本使用50 μg髓磷脂蛋白。样本在呼吸缓冲液中孵育，该缓冲液由120 mM KCl、2 mM MgCl₂、1 mM KH₂PO₄、50 mM Tris HCl（pH 7.4）和25 μg/ml氨苄青霉素组成。为观察偶联条件下的呼吸速率，首先加入0.7 mM NADH以刺激复合体I+III+IV通路并诱导氧消耗，然后5分钟后加入0.2 mM ADP以诱导呼吸状态3。为验证氧消耗依赖于氧化磷酸化蛋白的活性，加入40 μM鱼藤酮（复合体I抑制剂）。


生物发光荧光素酶ATP测定


从不同年龄大鼠脑中分离的髓磷脂（IM）的ATP合成首先将样本在37°C下孵育10分钟，孵育液含100 mM Tris/HCl（pH 7.4）、100 mM KCl、1 mM EGTA、2.5 mM EDTA、5 mM MgCl₂、0.2 mM二（腺苷-5'）五磷酸、0.6 mM哇巴因、氨苄青霉素（25 μg/ml）、5 mM KH₂PO₄、20 mM琥珀酸和0.7 mM NADH。为诱导ATP合成，在相同pH下向混合物中加入0.1 mM ADP。每份样本中的ATP浓度通过荧光素/荧光素酶化学发光法在发光计（Lumi-Scint，Bioscan）中测定，使用10⁻⁹至10⁻⁵ M的ATP标准溶液进行校准。


统计分析


数据为至少三次独立实验的均值±标准差。多组间统计比较采用单因素方差分析，继以Bonferroni事后检验。


结果


髓鞘形成过程中大鼠脑匀浆和分离髓磷脂中氧化磷酸化蛋白的表达


氧化磷酸化蛋白的基因在髓鞘形成期间增加。为确认这些数据，我们评估了从p5到p90大鼠脑匀浆中ATP合酶β亚基和ND4L的表达。作为阳性对照，使用了从p90大鼠分离的线粒体富集组分。蛋白质印迹和密度分析（分别为图1b和c）显示，ATP合酶和ND4L的信号与大鼠年龄从p5到p90平行增加。相反，不涉及氧化磷酸化代谢的线粒体蛋白TIM的信号降低。这通过ATP合酶与TIM信号比值的计算得到证实（图1d），该比值在髓鞘形成期间增加。

图1 大鼠脑匀浆中氧化磷酸化蛋白的表达


a板显示样本（Mit，线粒体富集组分；p90，成年大鼠脑匀浆；p5-33，出生后5至33天大鼠脑匀浆）经考马斯亮蓝胶体蓝染色的蛋白质图谱。b板显示针对ATP合酶、ND4L和TIM的半定量蛋白质印迹。这些信号的密度分析比值如c板所示。密度分析值以相对光密度（R.O.D.）的均值±标准差表示，经考马斯亮蓝胶体蓝染色的蛋白质图谱归一化。d板报告ATP合酶信号与TIM信号的比值。每板代表至少五次实验。

图2 分离髓磷脂中的氧化磷酸化蛋白


a板显示样本（Mw，分子量标准；Mit，线粒体富集组分；p90，成年大鼠分离髓磷脂；p5-33，出生后5至33天大鼠分离髓磷脂）经考马斯亮蓝胶体蓝染色的蛋白质图谱。b板显示针对ATP合酶、ND4L、MBP和TIM的半定量蛋白质印迹。这些信号的密度分析比值如c板所示。密度分析值以相对光密度（R.O.D.）的均值±标准差表示，经考马斯亮蓝胶体蓝染色的蛋白质图谱归一化。d板报告ATP合酶信号与MBP信号的比值。每板代表至少五次实验。


还评估了不同年龄大鼠分离髓磷脂中ATP合酶β亚基和ND4L的表达。图2b显示，这些蛋白的信号分别在大鼠p11和p7出现，并随动物年龄成比例增加。为验证髓鞘形成是否随大鼠年龄增加，进行了针对典型髓磷脂标记物MBP的蛋白质印迹分析。图2b显示，MBP表现出与ATP合酶和ND4L相同的趋势。ATP合酶与MBP信号比值的分析（图2d）也证实了数据，该比值在所有样本中显示相似值。相反，TIM和ANT（两种典型的线粒体内膜蛋白，不参与氧化磷酸化）的信号在分离髓磷脂（IM）中完全缺失，表明样本未被线粒体污染，如我们先前工作所证实。


为确认蛋白质印迹数据，对不同年龄大鼠脑切片进行了共聚焦显微镜分析，使用相同的抗MBP和抗ATP合酶抗体（图3）。图3a–f显示，MBP信号在p11出现，并随大鼠年龄和髓磷脂形成增加至p90。ATP合酶信号从p14增加至p90，并开始呈现与MBP信号相同的分布（图3w、x），即较少点状、更多线性。

图3 不同年龄大鼠前脑的免疫荧光分析


该图显示对不同年龄大鼠前脑横切面进行的免疫荧光分析，使用抗MBP（a–f）、抗ATP合酶（g–l）和DAPI（m–r）抗体标记细胞核。蛋白质通过间接荧光染色，使用Alexa-633偶联二抗标记MBP，Alexa-488偶联二抗标记ATP合酶。s–x板显示上述相应板的荧光合并图。每板代表至少三次实验。