摘要 我们先前的报道表明，电子传递链和F₀F₁-ATP合酶在髓鞘中有功能性表达，执行着线粒体外的氧化磷酸化（OXPHOS），为神经轴突提供能量。这支持了髓磷脂对轴突具有营养作用的观点。尽管四个电子传递链复合体和ATP合酶被认为是典型的线粒体蛋白，但它们被发现异位表达于多种膜结构中。本研究旨在了解线粒体氧化磷酸化机制在髓磷脂中是如何以及何时嵌入的，追踪大鼠髓鞘形成过程——该过程始于出生并持续到出生后第一个月。大鼠在不同时间点（出生后第5天至第90天）被处死。蛋白质印迹、免疫荧光显微镜、发光分析和氧测量分析显示，分离的髓磷脂在出生后约第11天开始表现出氧化磷酸化组分，并随大鼠年龄成比例增加，在出生后约第30天时与成年大鼠相似。有趣的是，蛋白质印迹数据显示髓鞘形成与线粒体融合和细胞转运相关蛋白的出现之间存在相同的时间关系。可以推测，氧化磷酸化复合体可能通过内质网膜（已知与线粒体相互作用）转移，并从那里通过高尔基体到达正在形成的髓磷脂膜。


引言


髓鞘是包裹轴突的多层改良质膜，由特化的胶质细胞产生，即外周神经系统的施万细胞（SC）和中枢神经系统的少突胶质细胞。直到最近，髓磷脂在加速轴突传导方面的关键作用仅被认为是一种绝缘能力。然而，一种尚未确定的营养作用已被归因于髓磷脂，因为在脱髓鞘疾病中，其丢失导致轴突退化，这是致残症状的主要原因。


自2009年以来，已在髓鞘中描述了线粒体外的ATP产生，这与神经系统的巨大代谢需求一致，而神经系统表现出较低的线粒体密度。特别是，已证实髓磷脂表达氧化磷酸化机制，以及糖酵解和三羧酸循环的酶，执行完整的葡萄糖分解代谢。还提出髓磷脂中产生的ATP可能通过连接蛋白形成的缝隙连接转移到轴突。蛋白质组学分析似乎支持这些发现。然而，氧化磷酸化机制从线粒体转移到髓磷脂的时间和方式尚不清楚。


工作假说是，鉴于有氧呼吸能力是髓磷脂的内在特征，髓鞘形成与氧化磷酸化机制复合体在髓磷脂中出现之间必须存在时间关系，可能与典型髓磷脂蛋白如髓磷脂碱性蛋白（MBP）的出现平行。选择大鼠作为实验模型，因为在啮齿动物中髓磷脂形成主要发生在出生后第一个月。有趣的是，Schoenfeld等人观察到在髓鞘形成期间编码氧化磷酸化蛋白的基因表达增加。由于从未鉴定出线粒体蛋白输出的特异性序列，可以合理地假设氧化磷酸化蛋白来源于线粒体——这种动态细胞器与其他细胞膜融合。因此，在本研究中，追踪了大鼠出生后不同时间点的髓鞘形成过程，以评估氧化磷酸化蛋白、MBP以及内质网和高尔基体蛋白在髓磷脂发育过程中的功能性表达。


材料与方法


样本


本研究使用由Harlan Italy srl公司（意大利乌迪内省圣皮耶特罗迪纳蒂索内）提供的斯普拉格-道利（SD）品系大鼠作为动物模型。研究在整脑上进行。大鼠在斩首前用乙醚麻醉。年龄以出生后天数表示。具体为：5只出生后5天的大鼠（p5）、5只出生后7天的大鼠（p7）、4只出生后11天的大鼠（p11）、4只出生后14天的大鼠（p14）、4只出生后33天的大鼠（p33），以及4只出生后90天的成年大鼠（p90）。后者作为阳性对照，因为我们先前的论文已表明从成年大鼠分离的髓磷脂表达功能性氧化磷酸化。实验获得意大利卫生部批准，符合所有动物护理要求，并严格遵守意大利法律（1992年1月27日第116号法令，符合欧洲议会和理事会2010年9月22日关于保护用于科学目的动物的2010/63/EU指令）。所有努力均用于最小化动物使用数量及其痛苦。


髓磷脂分离


采用Norton和Poduslo蔗糖梯度法的"浮选"改良法，从出生后第5天至第90天大鼠的整脑中分离髓磷脂，该方法可减少污染物。整个分离过程中均含有20 μg/ml氨苄青霉素、50 μg/ml 5-氟尿嘧啶和蛋白酶抑制剂混合物。离心使用Beckman FW-27转子（Beckman公司，美国加利福尼亚州富勒顿）。使用Potter-Elvehjem匀浆器从包含小脑和大脑前部的整脑中获得脑匀浆。脑组织在含有0.32 M蔗糖和2 mM EGTA的溶液中匀浆。匀浆物分层于1 ml含有2 mM EGTA的0.85 M蔗糖之上，以75,000×g离心30分钟。此步骤重复两次。含有线粒体、细胞核和细胞碎片的沉淀被丢弃，而位于两种蔗糖溶液界面的粗髓磷脂（由质膜和髓鞘组成）被收集并在水中匀浆至终体积1.5 ml。悬液以12,000×g离心10分钟。沉淀再次分散于总共1.5 ml水中，并以12,000×g离心10分钟。这些水中的步骤产生分离髓磷脂所需的渗透冲击。弃去上清液，而紧密沉淀物分散于水中并以75,000×g离心15分钟。收集髓磷脂沉淀并储存于-80°C。值得注意的是，尽管为标准化实验，上述程序应用于不同时间点获取的整脑，但出生后5、7和11天获取的脑样本并非由成熟髓磷脂组成，因为髓鞘仍在发育中。


线粒体富集组分分离


线粒体制备如下：4只成年大鼠的脑用PBS洗涤；然后在含有0.25 M蔗糖、0.15 M KCl、10 mM Tris HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA和0.5% BSA的缓冲液中匀浆。匀浆物以800×g离心10分钟；上清液过滤后以12,000×g离心15分钟；沉淀在含有0.225 M蔗糖、75 mM甘露醇、10 mM Tris HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA的缓冲液中重悬，并以1,000×g离心。最后，上清液以12,000×g离心15分钟，线粒体沉淀在后述缓冲液中重悬。


电泳分离和定量蛋白质印迹分析


变性电泳在8–18%丙烯酰胺梯度凝胶上使用Laemmli方案进行。每泳道加载20 μg髓磷脂或匀浆蛋白。转膜后，硝酸纤维素膜用以下一抗标记：抗髓磷脂碱性蛋白（MBP）小鼠单克隆抗体（AbCAM，1:10,000）；抗F₀-F₁ ATP合酶β亚基小鼠单克隆抗体（Sigma Aldrich，1:500）；抗复合体I亚基ND4L兔多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，1:200）；抗Giantin山羊多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，1:200）；抗OPA1兔多克隆抗体（Cell Signaling，1:200）；以及抗Calnexin兔多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，1:200）。此外，为评估脑匀浆中的线粒体密度以及髓磷脂中线粒体的存在/不存在，使用了抗线粒体内膜转位酶（TIM）山羊多克隆抗体和抗腺嘌呤核苷酸转位酶（ANT）兔多克隆抗体（均来自Santa Cruz Biotechnology，1:200）。蛋白质分子量标记来自Biorad。条带通过ChemiDoc XRS系统（Bio-Rad）可视化。定量密度测定使用ChemiDoc XRS+系统软件进行，数据以相对光密度（R.O.D.）表示，经考马斯亮蓝胶体蓝染色的全蛋白图谱归一化。总蛋白量通过Bradford法测定，以BSA为标准蛋白。