注射前，糖尿病动物的基础PO₂低于对照动物（分别为33.6±1.5 mmHg，n=8；44.1±3.2 mmHg，n=7；P<0.05）（图4）。L-精氨酸注射对两组肾皮质PO₂均无显著影响，而L-NAME降低了对照动物的PO₂。糖尿病动物L-NAME给药后PO₂也有降低趋势，但未达到统计学显著性。L-精氨酸注射对平均动脉血压无影响，但L-NAME注射使两组动物的平均动脉血压均升高（表1）。

图4. 对照组（n=7）和糖尿病大鼠（n=8）肾皮质氧张力对静脉注射L-精氨酸和L-NAME的平均变化。所有数值为均值±标准误。与同组基线相比P<0.05。空心柱，对照；实心柱，糖尿病。BW，体重。


非糖尿病动物和糖尿病动物的皮质PO₂与血流灌注之间均存在近似线性依赖关系（n=7，两组P<0.05，非糖尿病组曲线拟合度0.621，糖尿病组0.704）（图5）。两组间肾皮质血流灌注与PO₂的关系相似（多变量方差分析，P=0.23）。

图5. 肾皮质血流灌注与氧张力的关系。每组7只动物，每只动物5–6个测量点。空心菱形和虚线，对照动物；实心方块和实线，糖尿病动物。1. 糖尿病大鼠肾皮质一氧化氮底物限制对氧代谢和微循环的影响。


4周糖尿病动物的基础GFR低于对照动物（表1）。对照动物的GFR不受L-精氨酸注射影响，但L-NAME注射后显著降低。糖尿病动物中，L-精氨酸使GFR升高，而L-NAME未改变GFR。糖尿病动物的基础尿流率比对照动物高10倍（表1）。两组动物的尿流率均不受两种注射的影响。L-精氨酸注射未影响对照动物的钠排泄，而L-NAME注射使钠排泄增加（表1）。两种注射对糖尿病动物的钠排泄均无统计学显著影响，尽管L-NAME后的绝对值是对照水平的两倍以上。两种注射对对照动物或糖尿病动物的钾排泄均无影响（表1）。

对照动物（n=7） 糖尿病动物（n=8）
对照 L-精氨酸 L-NAME 对照 L-精氨酸 L-NAME
GFR（ml/min） 1.27 ± 0.03 1.26 ± 0.04 1.04 ± 0.02† 1.09 ± 0.06‡ 1.38 ± 0.11 1.19 ± 0.18
尿流率（μl/min） 1.7 ± 0.3 1.7 ± 0.3 1.9 ± 0.2 17.5 ± 3.2‡ 18.7 ± 3.5‡ 14.2 ± 3.0‡
钠排泄（pmol/min） 71 ± 19 68 ± 17 94 ± 21*† 156 ± 67 243 ± 98 382 ± 189
钾排泄（pmol/min） 354 ± 108 431 ± 93 429 ± 75 436 ± 83 586 ± 99 527 ± 105
平均血压（mmHg） 111 ± 4 113 ± 5 126 ± 7 110 ± 2 111 ± 2 120 ± 2
红细胞压积（%） 45 ± 1 45 ± 1 45 ± 1 46 ± 1 45 ± 1 46 ± 1
数据以均值±标准误表示。数值为各20分钟采样期的均值。*与相应对照期相比P≤0.05；†与同组L-精氨酸期相比P≤0.05；‡与对照动物相应期相比P≤0.05。


糖尿病动物的血浆精氨酸浓度显著降低，而ADMA和SDMA的血浆浓度与对照动物相似（表2）。

n L-精氨酸（μmol/l） ADMA（μmol/l） SDMA（μmol/l）
对照大鼠 8 127.9 ± 3.9 0.599 ± 0.017 0.328 ± 0.012
糖尿病大鼠 10 79.7 ± 6.7* 0.581 ± 0.078 0.366 ± 0.056
数据以均值±标准误表示。*与对照动物相比P≤0.05。


讨论


本研究证实了糖尿病动物肾皮质NO合成存在底物限制，伴随NO浓度降低。这些发现揭示了一种糖尿病诱导的肾脏氧代谢和局部血流调节改变的新机制，可能对糖尿病诱导的血管功能障碍的发展具有意义。


迄今为止，高血糖对肾NO浓度和血流灌注的影响报道结果差异很大。这些报道差异有几种可能的解释。使用不同的动物模型或人群以及不同的肾NO浓度估算技术可能解释部分差异。此外，NO的产生和生物利用度不一定是同一概念。


在本研究中，使用Whalen型微传感器记录体内生物可利用NO浓度。由于传感器的设计，可实现NO活性的直接在线测量。这些高灵敏度传感器已在多种体内条件下证明了其有用性。通过直接测量，我们观察到糖尿病大鼠肾皮质的NO浓度似乎发生了显著变化。假设L-NAME抑制全部或接近全部的NO合成，可以计算基础NO浓度：非糖尿病动物为87 nmol/l，糖尿病动物仅45 nmol/l，即基础NO水平降低48%。


L-精氨酸注射后，非糖尿病和糖尿病大鼠的肾皮质NO浓度均在数分钟内升高，表明细胞内NOS的产生增加，这与先前非糖尿病动物全身给予L-精氨酸后的观察结果相似。然而，在糖尿病动物中，L-精氨酸注射后NO浓度的升高幅度约为对照动物的四倍。这表明存在底物限制或NOS活性增加，或两者兼有。


NO合成高度依赖精氨酸的细胞转运，因此依赖于细胞外精氨酸的可利用性。这种可利用性受从头合成、细胞精氨酸转运和精氨酸酶降解速率的调控。NO合成还依赖O₂的可利用性和不同NOS亚型对O₂的米氏常数（Km）。糖尿病动物肾皮质平均基础组织PO₂较非糖尿病动物低24%，这可能是其基础NO水平低48%的一个影响因素。然而，我们的结果表明，L-精氨酸可利用性降低可能是更重要的因素。事实上，糖尿病动物的血浆精氨酸浓度比非糖尿病动物低38%（P<0.05），这与底物限制的概念一致。此外，本研究支持先前的发现，即组织NO浓度与细胞外精氨酸的可利用性密切相关。糖尿病动物血浆精氨酸水平降低的原因尚不清楚，但在饮食限盐期间也观察到类似的降低，并被证明是由于阳离子氨基酸2A y⁺转运蛋白过度细胞转运导致肝脏精氨酸代谢增加的结果。


体外实验表明，STZ诱导的糖尿病大鼠近端小管在存在高血糖时NOS活性升高。然而，糖尿病动物注射L-NAME后NO浓度的下降幅度不如对照动物大，进一步支持了在此条件下NOS存在底物限制的理论。此外，通过计算总NO信号（即在过量底物存在时的NO值与L-NAME抑制的总量之和），可以估算体内NO生物利用度的实际容量。非糖尿病动物为102 nmol/l，糖尿病动物为104 nmol/l，表明在底物可利用性不受限制时，两组产生生物可利用NO的能力相似。