肾皮质NO浓度采用凹陷式Whalen型金微传感器（尖端尺寸约5 μm）测量，该传感器由玻璃微吸管制成。微传感器相对于Ag/AgCl参比电极以-700 mV极化（安培法）。一氧化氮微电极在脱氧缓冲液中校准，缓冲液分别用100%氮气或NO与氮气的混合气体鼓泡。由于这些微传感器的特性以及校准只能在体外完成，在体内测量时仅能记录NO活性的相对变化。


皮质血流灌注采用激光多普勒血流仪测量（探头411，光密度0.45 mm，PF 4001-2；Perimed公司，瑞典斯德哥尔摩）。氧张力（PO₂）采用极谱法测量，使用改良的Clark型微电极（外径4–6 μm；Unisense 优尼森公司，丹麦奥胡斯）。氧微电极在37°C下用Na₂S₂O₅饱和水或空气饱和水进行两点校准。所有电极在立体显微镜下通过微操作器插入肾皮质（距肾表面约1.0 mm）。所有测量参数通过MacLab仪器（AD Instruments公司，英国黑斯廷斯）连接Macintosh Power-PC 6100连续记录。


实验结束时，从动脉导管抽取血样测定红细胞压积。解剖左肾以验证测量位点。若发现任何测量位点定位不正确，则排除该记录。同时测定肾脏重量。


血流灌注依赖性肾脏氧合的测量。 在左肾动脉上放置血管夹。在非糖尿病大鼠（n=7）和糖尿病大鼠（n=7）肾动脉夹闭后，按上述方法测量肾皮质血流灌注和PO₂。每只动物逐步收紧血管夹5–6次。每次收紧后，待数值稳定至少1分钟后读取血流灌注和PO₂。


尿液参数的测量。 采用液体闪烁法测量血浆（10 μl）和尿液（1 μl）中[³H]菊粉的放射性活度。然后计算[³H]菊粉清除率作为GFR。尿量采用重量法测定，渗透压采用冰点法测定（3MO型；Advanced Instruments公司，美国马萨诸塞州诺伍德），尿钠和尿钾浓度采用火焰分光光度计测定（IL543型；Instrumentation Lab公司，意大利米兰）。


血浆精氨酸、ADMA和对称二甲基精氨酸的测量。 分别从对照组（n=8）和糖尿病组（n=10）动物抽取约0.5 ml血液。采用高效液相色谱法同时测定血浆精氨酸、ADMA和对称二甲基精氨酸（SDMA）浓度。简要步骤如下：使用聚合物阳离子交换萃取柱进行固相萃取，以单甲基精氨酸为内标。经邻苯二甲醛试剂（含3-巯基丙酸）衍生化后，采用等度反相高效液相色谱分离，荧光检测。


统计分析。 所有数值以均值±标准误表示。两组间比较采用Student t检验（非配对比较）。多组间比较采用方差分析，继以Fisher保护性最小显著差异检验。同组内多次比较采用重复测量方差分析，继以配对比较的事后检验。线性回归用于分析灌注与氧合的关系，多变量方差分析用于比较不同组间血流灌注与氧合的关系（Statview软件；Abacus Concepts公司，美国加利福尼亚州伯克利）。所有比较中，P≤0.05视为具有统计学显著性。


结果


对照动物（n=22）血糖浓度为5.7±0.2 mmol/l，4周糖尿病动物（n=25）为23.2±0.5 mmol/l（与对照组相比P<0.05）。4周糖尿病动物的肾脏重量较对照动物增加（分别为1.38±0.05 g，n=25；0.97±0.02 g，n=22；P<0.05）。


L-精氨酸注射使糖尿病动物肾皮质NO浓度的升高幅度大于对照动物（图1）。L-NAME注射使两组肾皮质NO浓度均显著降低，但对照动物的降低幅度更大。糖尿病动物和对照动物的基础肾皮质血流灌注相似（分别为318±15，n=8；339±17激光单位，n=7；无显著差异），L-精氨酸注射后增加，L-NAME注射后降低。L-NAME给药后的降低幅度在糖尿病动物中最大（图2和图3）。

图1. 对照组（n=7）和糖尿病大鼠（n=8）肾皮质生物可利用NO浓度对静脉注射L-精氨酸和L-NAME的最大变化。所有数值为均值±标准误。与同组基线相比P<0.05，†与相应处理的对照组相比P<0.05。空心柱，对照；实心柱，糖尿病。BW，体重。

图2. 对照组（n=7）和糖尿病大鼠（n=8）肾皮质血流灌注对静脉注射L-精氨酸和L-NAME的平均变化。所有数值为均值±标准误。与同组基线相比P<0.05，†与相应处理的对照组相比P<0.05。空心柱，对照；实心柱，糖尿病。BW，体重。

图3. 一只对照动物和一只糖尿病动物在静脉注射L-精氨酸和L-NAME前后的肾皮质血流灌注代表性个体记录。