结果


发育阶段对胚胎TBARS水平和氧气消耗率的影响

图2显示了在未驯化胚胎上测量的TBARS水平与组成样本的卵数之间的回归，根据胚胎的发育阶段。TBARS水平随卵数的增加而降低。此外，ANCOVA揭示了S1胚胎对应的回归斜率与所有其他胚胎对应的回归斜率之间存在显著差异。S2、S3和S4胚胎之间的成对关系没有显著差异。也就是说，TBARS水平随卵数增加的降低幅度在S1胚胎中比在老胚胎中更平缓。

图3显示了在未驯化但处于不同发育阶段的胚胎中测量的氧气消耗率。氧气消耗率根据胚胎的生长阶段S1-S4显著增加。


温度条件对胚胎TBARS水平和氧气消耗率的影响

图4显示了S1胚胎在不同温度条件（波动（野外）与恒定（实验室））下测定的TBARS水平。TBARS水平随卵数的增加而降低。此外，ANCOVA未揭示驯化至恒定温度的胚胎的回归与暴露于波动温度的胚胎的回归之间存在任何显著差异。也就是说，卵数对TBARS水平的影响对所有胚胎都是相同的，无论是驯化的还是来自野外的。否则，ANCOVA揭示了温度条件对TBARS水平的显著影响。对于卵数相似的育卵，驯化至恒定温度的胚胎的TBARS水平略高于驯化至波动温度的胚胎。

图5显示了驯化至不同温度条件（波动（野外）与恒定（实验室））的S4胚胎的氧气消耗率，未显示显著差异。


讨论


在这项工作中，我们研究了波动温度与恒定温度条件对钩虾不同胚胎阶段胚胎生理学的影响。我们旨在测量两个热应激生理指标：代谢率和氧化损伤水平。


发育阶段对胚胎TBARS水平和氧气消耗率的影响


TBARS水平代表磷脂过氧化（因此代表氧化损伤），在年轻胚胎（S1）中似乎总体上低于老胚胎。这一观察可以通过了解导致生物体氧化损伤的活性氧（ROS）的主要来源是线粒体能量代谢来解释。与老胚胎（S4）相比，S1胚胎细胞很少，因此线粒体也较少。这种较低的总体线粒体活性可能导致年轻胚胎产生较少的ROS，从而导致较低的磷脂过氧化水平。然而，尽管线粒体数量在发育过程中随着细胞增殖而增加，但S2、S3和S4胚胎之间的TBARS水平似乎没有差异，表明氧化损伤在胚胎发生期间没有增加。这种缺失，尽管ROS产生可能增加，可能是由于在发育过程中建立了防御机制来对抗细胞中的ROS产生，正如最初假设的那样。以前研究的发现与我们的假设一致，表明淡水鱼胚胎的早期阶段不产生抗氧化酶，而老胚胎产生这些酶（主要是超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶）以防止氧化损伤。然而，这种解释需要额外的研究。确实，本研究强调了组成钩虾雌性育卵的卵数对TBARS水平的影响。也就是说，氧化损伤水平随着组成育卵的卵数增加而降低，尽管TBARS水平已按育卵质量单位表示。从生态学上讲，这种关系表明大育卵（即卵数多）比小育卵（即卵数少）呈现更少的氧化损伤。据我们所知，这种机制的解释仍然未知，没有找到文献来评估或拒绝这一观察。脂质过氧化率（指示氧化损伤水平）与生物体中的脂质数量直接相关。关于卵脂质含量的更多信息可能有助于解释为什么氧化损伤水平会随着组成育卵的卵数增加而降低。继本工作之后，未来关于钩虾胚胎能量储备的研究似乎很有趣。


氧气消耗率在胚胎发育过程中显著增加。因此，我们假设线粒体活性在胚胎发生期间增加，因为这种反应似乎是甲壳类物种的一般模式。胚胎发生期间氧气消耗率的这种变化也在鸟类胚胎和鱼类胚胎中观察到。同时，卵的干质量——主要由胚胎和相关能量储备组成——在整个发育过程中保持稳定：细胞数量随时间强烈增加，但初始能量储备被逐步消耗。因此，细胞中更多线粒体消耗更多氧气，导致代谢率显著增加。Dick等人研究了钩虾雌性在胚胎阶段的母体护理行为，特别是通过腹肢拍动进行育卵通风。关于他们的结果，他们假设育卵代谢需求随着胚胎发育而增加。此外，这些作者还观察到老钩虾胚胎（S4）积极地进行自我通风，用它们自己的腹肢（因此产生氧气消耗率超调），这与我们目前的结果一致，显示S4中每质量单位的代谢率更高。


温度条件对胚胎TBARS水平和氧气消耗率的影响


关于TBARS水平，已经强调了组成雌性育卵的卵数的影响。然而，这种反应对所有胚胎都是相似的，无论温度条件（恒定或波动温度）如何。对于恒定温度（实验室）下的胚胎，TBARS水平似乎高于波动温度（野外）下的胚胎。这一趋势的正确性，尽管与我们的初始假设一致，但在不知道极端育卵大小（包含非常多或非常少的卵）的情况下是否会保持这一趋势时，是有限的。尽管如此，这一趋势表明恒定温度下胚胎脂质中的氧化损伤更多，或损伤修复比波动温度下发生得更少。我们的研究无法区分这两种解释。然而，研究表明，暴露于温度波动的陆地昆虫（小粉虫）成虫（i）在温度范围的较冷时段呈现氧化损伤，如脂质过氧化，（ii）在较暖时段显示对抗氧化应激的酶促反应，允许损伤修复，突出表明波动温度的应激性低于恒定温度。此外，Boardman等人在陆地昆虫幼虫（假苹果蠹蛾）上证明，与恒定温度相比，波动温度似乎对寒冷损伤具有保护作用，特别是由于热休克蛋白的产生增加。最近，Madeira等人研究了不同沿海蟹类的热耐受性，他们强调占据较冷和较稳定温度生态位的物种往往在比较温暖和更多变的温度生态位的物种更低的温度下呈现细胞应激生物标志物（脂质过氧化和HSP70表达）的峰值。还发现钩虾胚胎在热应激情况下产生热休克蛋白。根据这些发现，我们可以假设我们的第二种解释更有可能：对于暴露于恒定温度的胚胎，由于缺乏有利于恢复的时期，氧化损伤的修复可能显著降低。


然而，为了测试温度条件的影响，TBARS水平在S1胚胎上测量，而氧气消耗率的测量在S4胚胎上进行。因此，我们必须对我们解释温度条件对胚胎生理学影响的观点进行修正。确实，为了推广观察到的波动温度条件对氧化损伤和代谢率的影响，需要对老胚胎（S4）的TBARS水平进行调查。这项调查将确定水平是否像年轻胚胎中那样，对于波动温度下的胚胎低于恒定温度下的胚胎，尽管代谢率相似。此外，与实验室条件相比，自然环境中的生物和非生物参数不是恒定的。因此，无法确定野外胚胎中观察到的氧化损伤是否仅由波动温度条件引起，或者其他环境参数是否涉及，即使胚胎在雌性育卵囊中发育。


结论


这项关于波动温度与恒定温度对淡水甲壳类动物胚胎代谢率和氧化损伤影响的创新研究，为外温动物胚胎的热生理学提供了新的见解。我们的结果表明，对少量胚胎（少于10个）来自单个雌性的氧气消耗率测量是可能的；这种方法对于评估个体反应是相关的。我们的研究还揭示，氧化损伤的变化（此处的TBARS水平）可能在发育阶段发生，但需要额外的研究来阐明这些变化。此外，年轻胚胎中TBARS水平的显著差异表明，波动温度可能具有保护作用，要么允许细胞损伤修复，要么导致胚胎中的氧化应激比恒定温度下更少。然而，由于我们的实验设计，很难完全评估本研究中观察到的氧化损伤是否仅由波动温度条件引起。我们还发现，氧气消耗率在胚胎的生长和发育过程中显著增加，这与其他甲壳类物种研究的发现一致。然而，代谢率似乎不受生物体所经历的温度条件的影响，至少对于老胚胎（S4）是如此。众所周知，气候变化将导致总体温度上升，特别是导致极端事件，如干旱，涉及更严重和快速的温度升高。因此，额外的工作应集中在波动温度对各种物种淡水胚胎发育的影响上。淡水栖息地中功能重要的生物体的常年密度对于保护这些生态系统至关重要。因此，通过评估允许发育和存活的温度极限来获取关于成功繁殖所需热条件的更多知识似乎是必不可少的。