讨论


啤酒中的早期氧化反应可以用方案1所示的机制来描述，该机制基于铁催化的氧气捕获导致过氧化氢的初始形成，然后通过芬顿反应引发乙醇氧化。在本研究中，重点在于铁作为促氧化催化剂；然而，痕量水平的铜预计发挥与铁类似的作用。基于模型研究，已为葡萄酒中金属催化氧化提出了类似的机制，因此它们可能对广泛的酒精饮料具有普遍相关性。氧气既在过氧化氢的初始形成中被消耗，也在乙醇氧化循环中被消耗，因此耗氧速率是氧化方案两部分总和的度量。ESR滞后期测量基于捕获1-羟乙基自由基，该自由基是乙醇氧化的核心中间体。


乙醇氧化涉及氢过氧自由基的形成，其歧化生成氧气和过氧化氢（反应4）。因此，乙醇氧化的总化学计量等价于反应5，这强调了过氧化氢和 Fe(II) 与氧气一起被消耗。


2 HOO• → H2O2 + O2    (4)


2 CH3CH2OH + O2 + H2O2 + 2 Fe2+ + 2 H+ → 2 CH3CHO + 4 H2O + 2 Fe3+    (5)


H2O2 + HSO3- → H2O + SO42- + H+    (6)


过氧化氢是方案1中将初始氧气捕获与乙醇氧化联系起来的核心中间体。然而，过氧化氢也可能与亚硫酸盐反应（反应6），该反应与芬顿反应（反应1）之间的竞争决定了被氧化的乙醇量。在葡萄酒中，已证实芬顿反应与 H2O2 和亚硫酸盐的直接反应之间存在类似的竞争。本研究中使用的啤酒含有 140μM 亚硫酸盐。在 8 h 大气空气条件下保存啤酒导致 92μM 氧气的线性消耗（图1）。在相同条件下，仅消耗了约 60μM 亚硫酸盐（图6），这表明乙醇氧化在一定程度上与亚硫酸盐的反应同时发生，根据反应5导致额外的氧气消耗。发现亚硫酸盐的消耗主要取决于 H2O2 的添加，而不取决于铁的添加（图5），这支持了亚硫酸盐与过氧化氢之间的直接反应。在本研究使用的啤酒中，也观察到了这种竞争，因为当添加递增的 H2O2 浓度时，观察到更短的ESR滞后期，而在 Fe(II) 存在下，啤酒中形成的自由基初始水平也随 H2O2 浓度增加而增加（图4A）。


H2O2 参与芬顿反应（导致乙醇氧化）或与亚硫酸盐反应的竞争取决于两条反应路径的动力学。H2O2 与亚硫酸盐反应的速率常数约为 103 M-1 s-1，而芬顿反应的速率常数从60 M-1 s-1 到 105 M-1 s-1 不等，具体取决于 Fe(II) 的配体。因此，亚硫酸盐浓度与 Fe(II) 浓度的比值决定了哪条反应路径将占主导地位，当高铁含量存在时，过氧化氢通过芬顿反应消耗，而在低铁浓度下，与亚硫酸盐的反应是主要途径。因此，亚硫酸盐的消耗及其作为抗氧化剂的效率将直接与存在的铁离子和铜离子的相对量相关。


单独添加铁对耗氧速率和亚硫酸盐消耗的影响很小，表明对氧气初始捕获的影响可忽略不计。然而，当过氧化氢也被添加时，铁的添加产生了影响，根据方案1，这将直接引发乙醇氧化。有趣的是，添加 Fe(III) 或 Fe(II) 对啤酒强制老化过程中的耗氧、自由基形成、ESR测定的滞后期以及亚硫酸盐浓度的降低具有相同的效果。Uchida和Ono已证明 Fe(II) 在啤酒中具有促氧化活性，可缩短ESR滞后期，但他们的研究中未包含 Fe(III)。最近，Kunz等人表明，具有烯二醇结构的美拉德反应中间产物能够将啤酒中的 Fe(III) 还原为 Fe(II)。假设啤酒中 Fe(II) 和 Fe(III) 物种之间存在快速的氧化还原平衡，可以解释添加这两种物种的相似效果。多酚和亚硫酸盐已被证明可有效将葡萄酒中的 Fe(III) 还原为 Fe(II)。然而，多酚在啤酒中扮演类似角色的可能性较小，因为它们既不抑制也不增加自由基的形成。在本研究中，我们观察到添加 Fe(III) 不影响亚硫酸盐浓度，这表明与葡萄酒不同，啤酒中的亚硫酸盐不能还原 Fe(III)。这可能是由于pH值以及啤酒和葡萄酒中存在的配体类型不同所致。在葡萄酒中，铁离子与酒石酸和苹果酸配位。在啤酒中，铁以带负电、带正电和中性物种的混合物形式存在，表明与多种配体配位。


啤酒中硫醇的浓度在不同孵育条件下下降（图6B），但下降幅度不如亚硫酸盐明显。这表明硫醇在啤酒中作为抗氧化剂起次要作用。由于观测到半胱氨酸的速率常数较低（10-2 到 10-3 M-1 s-1），预计硫醇不会与 H2O2 有效反应。因此，添加 180μM H2O2 对硫醇浓度的影响小于对亚硫酸盐浓度的影响（图6）。据推测，一旦啤酒中亚硫酸盐耗尽，硫醇通过去除1-羟乙基自由基（方案1）作为次级抗氧化剂发挥作用。该反应的高速率常数 109 M-1 s-1 支持了这一点。然而，硫醇将与同样以类似高速率常数与1-羟乙基自由基反应的酒花衍生的苦味酸竞争。最近，有人提出啤酒中的亚硫酸盐和硫醇可能与老化醛类可逆结合形成加合物，并且这些醛类可能在啤酒老化过程中释放。基于本研究的结果，与亚硫酸盐结合的醛类将首先被释放，随后硫醇加合物在啤酒氧化的后期阶段释放。此外，大部分硫醇似乎能抵抗氧化，表明啤酒硫醇具有广泛不同的氧化还原特性。有趣的是，观察到硫醇的消耗不像亚硫酸盐消耗那样依赖温度。这一观察结果与之前在22和 35°C 下进行的啤酒储存实验一致，在该实验中，亚硫酸盐在 35°C 下耗尽更快，而硫醇的消耗对温度的依赖性较小。这可能表明，暴露于热（例如在长途运输期间）的啤酒将耗尽其亚硫酸盐（主要抗氧化剂）含量，但仍可能含有硫醇作为次级抗氧化剂。


发现啤酒中耗氧的温度依赖性异常低，Q10 为1.3，这很可能是由于初始捕获氧气的反应焓较低。与单独添加铁或 H2O2 相比，向啤酒中添加铁和 H2O2 的组合导致氧化速率增加（通过耗氧量测定）和自由基形成增加（通过ESR光谱测定），这与啤酒中芬顿介导的氧化导致乙醇氧化和1-羟乙基自由基的形成一致。发现亚硫酸盐与芬顿反应竞争 H2O2，亚硫酸盐的主要抗氧化机制是通过与 H2O2 的直接反应，而蛋白质硫醇被建议通过去除1-羟乙基自由基在啤酒中作为抗氧化剂发挥次要作用。基于这些结果，将有可能开发定量的动力学模型，这些模型可能用于预测啤酒的保质期以及各种内源性和外源性因素组合的影响。