摘要：通过跟踪耗氧速率、电子自旋共振光谱检测到的自由基形成以及抗氧化化合物亚硫酸盐和硫醇的浓度，研究了啤酒储存早期阶段发生的自由基介导的反应。添加 Fe(III) 或 Fe(II) 具有相似的效果，表明啤酒中这两种物质之间可快速达到氧化还原平衡。铁与过氧化氢的组合添加引起了最显著的氧化水平，这是由于通过芬顿反应产生羟基自由基，直接引发了乙醇氧化。亚硫酸盐浓度的下降幅度大于硫醇浓度，这表明硫醇作为抗氧化剂主要发挥次要作用，主要通过清除乙醇氧化过程中产生的中间体1-羟乙基自由基。升高温度对耗氧速率的影响较小。


引言


啤酒的风味稳定性和氧化稳定性密切相关，因为许多不良的异味是在储存过程中通过氧化过程产生的。此外，负责新鲜风味特征和苦味的化合物，例如酒花衍生的异-α-酸，会因氧化而降解。特别是淡色啤酒通常具有细腻的香气特征，很容易因氧化而改变，因为储存过程中形成的老化味物质具有非常低的风味阈值。在啤酒中，痕量的铁和铜催化大气中氧气的初始活化以及随后不同活性氧物种的形成，从而导致啤酒中的氧化损伤。过氧化氢，H2O2，是啤酒中形成的一种重要的活性氧物种，它可以与低价态的铁和铜，Fe(II) 和 Cu(I)，反应，通过芬顿反应（反应1）生成高反应活性的羟基自由基。


Fe2+ + H2O2 + H+ → Fe3+ + •OH + H2O    (1)


•OH + CH3CH2OH → H2O + CH3•CH(OH)    (2)


CH3•CH(OH) + O2 → CH3CH(OH)OO• → CH3CHO + HOO•    (3)


羟基自由基以接近扩散控制的速率与大多数有机化合物反应，因此几乎没有选择性。由于乙醇是啤酒中除水之外含量最丰富的成分，羟基自由基将优先与乙醇反应生成1-羟乙基自由基（反应2）。进一步与氧气反应导致形成1-羟乙基过氧自由基，其分解形成乙醛和氢过氧自由基（反应3）。当浓度足够时，乙醛的形成会产生类似碰伤苹果、雪利酒和/或坚果的异味，从而影响啤酒的风味。反应1-3中所示的自由基都能够与啤酒中的其他成分（如蛋白质、多酚和酒花衍生化合物）发生反应。这些副反应将导致浑浊的形成以及苦味的丧失，因此会对啤酒质量产生直接的负面影响。因此，详细了解啤酒复杂的氧化机制对于实现良好的氧化稳定性和充分利用啤酒中潜在的内源性抗氧化剂至关重要。


淡色啤酒通常含有亚硫酸盐，它是由酵母在发酵过程中产生的，并且是啤酒中一种有效的抗氧化剂，通过与 H2O2 发生非自由基反应来去除它，在 pH 4.2 条件下的二级反应速率常数约为 103 M-1 s-1。亚硫酸盐作为啤酒中抗氧化剂的效率，即啤酒的氧化稳定性，可以通过在 60°C 下强制老化并结合自旋捕获和电子自旋共振光谱测定自由基的形成来评估。在淡色啤酒中，通常在初始滞后期后观察到自由基的加速形成，并且该滞后期长度已被发现与亚硫酸盐浓度相关。强制老化过程中检测到的自由基是1-羟乙基自由基，这些自由基主要在 H2O2 与芬顿反应中的 Fe(II) 反应时形成，即当亚硫酸盐耗尽后，继之以乙醇与羟基自由基之间的反应（反应2）。含硫醇的蛋白质也被认为通过在啤酒中催化去除 H2O2 而起到抗氧化剂的作用，但蛋白质硫醇在啤酒中作为抗氧化剂的确切作用机制尚未阐明。硫醇浓度已被发现与ESR光谱测得的滞后期相关，并且含硫醇的啤酒蛋白脂质转移蛋白1已被证明具有高自由基清除能力。


本研究旨在主要通过跟踪耗氧速率，研究啤酒中早期氧化过程阶段的反应机制。氧气是氧化反应中的核心反应物，因此消耗的氧气量是氧化总程度的极好度量。然而，尽管该技术已成功用于葡萄酒氧化机制的机理研究，但迄今为止尚未用于啤酒氧化反应的机理研究。本研究的重点是表征对金属催化氧化反应中自由基形成至关重要的化合物之间的相互作用。这包括通过ESR检测中间自由基的研究，以及啤酒中亚硫酸盐和硫醇的抗氧化特性的表征。


材料与方法


化学品。 ThioGlo 1荧光硫醇试剂购自Berry & Associates, Inc.。乙腈、谷胱甘肽、FeSO4·7H2O, H2O2、N-叔丁基-α-硝酮、1-辛醇、盐酸和2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基购自Sigma-Aldrich。三羟甲基氨基甲烷、Fe2(SO4)3·H2O、三氟乙酸和抗坏血酸钠购自Merck。亚硫酸钠购自J.T. Baker。所有化学品均为分析纯或最高纯度。水通过Milli-Q纯水系统纯化。


从当地超市购买全麦比尔森啤酒，在 4°C 避光储存。所有瓶子来自同一生产批次，重复分析使用不同的瓶子进行。实验前，将 150 mL 啤酒在蓝盖瓶中搅拌 5 min 以脱气。通过加入 15 μL 1-辛醇防止过度起泡。


啤酒的强制老化。 强制老化通过在升高温度下孵育啤酒或添加芬顿试剂（单独或组合添加不同浓度的 Fe(II) 或 Fe(III) 和 H2O2）进行。所有试剂每日新鲜配制。具体条件和浓度在每个图的图注中给出。