GSDMD 作为焦亡必需组分的鉴定


在焦亡过程中，细胞膜上形成孔道，细胞内容物随着死亡细胞染色而释放。因此，接下来我们测量了乳酸脱氢酶（LDH）和 IL-1β 的释放量，作为渗透性裂解的指标，这可以通过细胞死亡百分比和 OD450 值分别确定。我们研究了氢气是否通过 ROS 和 NLRP3 炎症小体决定焦亡细胞死亡，或者 GSDMDNterm 表达是否诱导了焦亡特征的终末裂解型细胞死亡。


我们通过使用携带 GSDMD shRNA 的慢病毒转染 Ishikawa 细胞（包括三对 GSDMD 基因 shRNA 干扰片段（RNAi-1、RNAi-2 和 RNAi-3）以及一对阴性对照（NC））进行了 GSDMD 敲低实验。蛋白质印迹分析显示，与 NC 组相比，GSDMD 敲低的 Ishikawa 细胞中 GSDMDNterm 蛋白水平下调（图 6b）。选择转染效率提高（78.8%）的 RNAi-1 用于后续实验（图 6a-c）。


与正常培养组相比，氢气处理显著增加了 HEC1A 和 AN3CA 细胞的细胞死亡百分比（图 6d）和 OD450 值（图 6g）。在 Ishikawa 细胞中，与 CM 组相比，氢气处理刺激了显著更高的 LDH 释放（P<0.05）（图 6e），并且 OD450 值甚至更高（P>0.05）（图 6h）。这些结果验证了分子氢在子宫内膜癌中诱导了焦亡。LPS 和尼日利亚菌素处理进一步上调了 LDH 和 IL-1β 的释放（P<0.05），而在氢气刺激下，NAC-、MCC950- 或 caspase-1 抑制剂 VX-765 处理的 HEC1A 和 Ishikawa 细胞中 LDH 释放减少（P<0.05），证实了氢气通过 ROS-NLRP3-caspase-1 途径诱导焦亡（图 6d，g）。


氢气处理也上调了 GSDMD 敲低的 Ishikawa 细胞中的 LDH 释放（图 6e），但未能诱导 IL-1β 释放（图 6h）。当氢气处理的 Ishikawa 细胞中 GSDMD 被敲低时，LPS 和尼日利亚菌素增强了 LDH 的释放（P<0.05）（图 6e），而 NAC 未能诱导 IL-1β 释放（图 6h）。GSDMD 敲低减少了 H-CM 和 CM 处理的 Ishikawa 细胞中 LDH 的释放（图 6f）和 IL-1β 的产生（图 6i）（P<0.05）。我们在 LPS 和尼日利亚菌素或 NAC 处理的 Ishikawa 细胞中观察到类似的结果，表明 GSDMD 敲低抑制了子宫内膜癌细胞中的焦亡细胞死亡（P<0.05）。然而，当 GSDMD 被沉默时，有或没有氢气处理的不同组 Ishikawa 细胞之间的 IL-1β 释放没有显著差异（图 6h）。因此，我们假设 GSDMD 是子宫内膜癌细胞中焦亡序列的终末蛋白，并且 GSDMD 介导的 IL-1β 分泌是通过 ROS-NLRP3-caspase-1 信号通路发生的，该通路由激活效应分子氢诱导。

图6：GSDMD 是氢气诱导的子宫内膜癌细胞焦亡所必需的。（a-c）在 Ishikawa 细胞中，通过慢病毒转导 GSDMD 特异性 shRNA（RNAi-1， -2， -3）或阴性对照 shRNA（NC）敲低 GSDMD。（a）转染效率的荧光图像（绿色）。（b）敲低效率的蛋白质印迹验证。（c）GSDMD mRNA 相对表达水平的 RT-qPCR 分析。（d-i）在不同子宫内膜癌细胞系（HEC1A， AN3CA， Ishikawa）及 GSDMD 敲低的 Ishikawa 细胞中，测量乳酸脱氢酶（LDH）释放（细胞死亡指标）和 IL-1β 分泌（ELISA）以评估焦亡。细胞经指定处理：正常培养基（CM）、富氢培养基（H-CM）、LPS+尼日利亚菌素（Nig， 焦亡激活剂）、N-乙酰半胱氨酸（NAC， ROS 抑制剂）、MCC950（NLRP3 抑制剂）、VX-765（Caspase-1 抑制剂）。数据表示为均值 ± 标准差（n=3）。*P < 0.05，与 CM 组比较；#P < 0.05，与 H-CM 组比较；&P < 0.05，与 NC shRNA 组比较。


富氢水处理抑制体内子宫内膜肿瘤发生


接下来，我们旨在确定饮用富氢水是否会抑制子宫内膜癌小鼠模型中的肿瘤生长。九只 BALB/c 小鼠在右肩皮下植入 1x10^7 个 AN3CA-LUC 细胞，并每天自由饮用浓度为 1.0 ppm 的富氢水（HRW：H1, H2, H3, H4, H5, H6）或纯化水正常对照（NC：P1, P2, P3）。肿瘤于 2019 年 3 月 31 日在 H1、H2、H3 和 P1、P2、P3 小鼠身上开始生长，而肿瘤于 2019 年 5 月 13 日在 H4、H5 和 H6 小鼠身上开始生长。出于伦理考虑，H1、H3 和 P2 小鼠在体积增加到 770.73-901.69 mm3 时于第 14 天处死，H4、H5 和 H6 小鼠在体积增加到 2317.83-4456.70 mm3 时于第 17 天处死，因此我们记录了 H2、P1、P3 小鼠 24 天的数据，H1、H3、P2 小鼠 14 天的数据，以及 H4、H5、H6 小鼠 17 天的数据。


HRW 组小鼠在第 1 天体重为 18.1、19.2、20.1、17.0、21.3、17.9（克），NC 组小鼠体重为 19.4、22.2、21.1（克）。在整个实验期间监测饮水量，各组之间几乎相同。富氢水给药减少了子宫内膜肿瘤的生长和肿瘤体积（mm3）（图 7a）。与对照组相比，HRW 组小鼠的体重（克）在大部分观察日（第 1-10、19-24 天）有所减轻（图 7c）。HRW 组肿瘤体积增加的速度在第 7、14-19 天也逐渐下降。我们认为小鼠体重和肿瘤体积并未在所有观察日持续下降的原因是个体差异。由于九只小鼠在第 1 天的绝对小鼠体重和肿瘤体积不同，为了平衡个体差异，我们认为观察肿瘤体积的相对增加更有意义。因此，将第一天的肿瘤体积定义为 1，记录增加或减少比例的持续时间作为相对肿瘤体积。我们观察到，与对照组相比，HRW 组在所有观察日（第 1-24 天）的相对肿瘤体积均下降（图 7b）。这些观察表明，氢气在异种移植小鼠模型研究中具有抗肿瘤作用，但由于样本量有限，需要扩大样本量进行进一步研究。我们接下来证明，饮用富氢水降低了子宫内膜肿瘤在异种移植小鼠模型中的体积。我们给予富氢水（HRW）的小鼠在 12 天后显示出放射性强度（ROI）降低，通过发光分析评估，表明肿瘤密度较低（图 7d）。小鼠 H1、H3 和 P2 在第 13 天处死，而小鼠 H2 和 P1 在第 24 天处死。由于样本量的限制，我们观察到 HRW 组在第 12、13、24 天的总 ROI 呈下降趋势（图 7e）。因此，我们的研究表明，氢气在子宫内膜癌中发挥抗肿瘤作用。接下来，我们进行了 IHC 染色，以探索氢气诱导的抗肿瘤作用是否与焦亡相关。

图7：饮用富氢水抑制异种移植小鼠模型中子宫内膜肿瘤的生长。（a）在整个实验期间（24 天），富氢水（HRW）组和正常对照组（NC）小鼠的肿瘤体积（mm³）生长曲线。数据显示为个别小鼠（细线）和组平均值（粗线）。(b) 相对肿瘤体积（以第 1 天体积为 1 进行标准化）的变化。(c) 小鼠体重（克）变化曲线。(d) 在实验第 12、13 和 24 天，通过活体成像系统测得的代表性生物发光图像（上排）和相应的肿瘤照片（下排），显示 HRW 组（H2， H4， H5， H6）和 NC 组（P1， P3）小鼠的肿瘤发光强度（ROI）。(e) 第 12、13 和 24 天总发光通量（ROI）的定量分析。数据表示为均值 ± 标准差。*P < 0.05，与 NC 组比较。