线粒体 ROS 水平的测量


使用 MitoSOX Red 检测方法测量线粒体 ROS。首先，将 50μg MitoSOX 超氧化物指示剂溶解在 5 mM MitoSOX 试剂储备溶液中，与 10 uM MitoSOX 试剂在 37°C 孵育 10 分钟。染色的细胞用 Tecan M100 复染并在温缓冲液中进行荧光成像。


碘化丙啶（PI）染色


细胞在 12 孔板中培养，用冷 PBS 洗涤两次，悬浮于 500μl 结合缓冲液中。加入 5 ng/mL 碘化丙啶（PI）以检测细胞膜完整性，避光在室温下孵育 15 分钟。用 PI 染色细胞，并立即用流式细胞仪进行分析。使用 Olympus IX71 和 ImageJ 软件捕获和处理焦亡细胞的静态明场照片。阳性细胞数/总细胞数 x 100% 代表 PI 阳性细胞比例，与未处理细胞的 PI 染色背景进行对比。


TUNEL 检测


使用比色 TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记（TUNEL）凋亡检测试剂盒，按照制造商说明书标记核酸的末端，将从染色细胞中 DNA 的缺口鉴定为 TUNEL 阳性核。通过显微镜在每个视野的三个随机选择区域中计数每 100 个细胞中的 TUNEL 阳性细胞。


乳酸脱氢酶（LDH）释放的测量


非刺激条件下的细胞内 LDH 总量比例被视为细胞外 LDH 活性。通过 LDH 细胞毒性检测试剂盒测量细胞外乳酸脱氢酶（LDH），以检测焦亡细胞死亡，按照制造商的说明进行。细胞以 6x10^3 个细胞/孔的密度在 H-CM 和 CM 中培养并孵育 12 小时，加入 1μg/mL 多西环素，收集上清液和细胞裂解物，在 48 小时后分析 LDH 释放。


IL-1β 酶联免疫吸附测定（ELISA）


使用人 IL-1β ELISA 检测试剂盒分析 HEC1A、AN3CA 和 Ishikawa 细胞裂解物或培养基中的 IL-1β，按照制造商的说明进行。细胞在 24 孔板中培养过夜，使用 100 ng/mL 的 LPS 在 4°C 激活细胞 4 小时以刺激 NLRP3 炎症小体，然后用 10μM 的尼日利亚菌素引发 2 小时。为了生成无细胞培养基以去除死亡细胞，我们收集细胞上清液，在 300g，4°C 离心 8 分钟，浓缩上清液，在 12,000g，10kDa 截留，4°C 反复离心 30 分钟。使用 R&D Systems 在 450 nm 处测量 IL-1β 水平。


GSDMD shRNA


我们设计了三个短发夹 RNA（shRNA）序列，并根据小干扰（siRNA）序列由上海 GeneChem 有限公司检测了 shRNA 表达盒。将退火的寡核苷酸序列插入到消化的 GV493 载体的 Phu6 和 Pubi 位点之间以生成 shRNA 载体。使用 GV493 质粒（1.5x10^8 TU/mL 时 2μl，8 x10^8 TU/mL 时 3.75μL，6 x10^8 TU/mL 时 5μL）在 6 孔板中用 GV493 或 GSDMD 特异性 shRNA 颗粒（含 6mg/mL 的聚凝胺）感染 Ishikawa 细胞，加入 2 mg/mL 的嘌呤霉素以生成稳定克隆，与空载体进行比较。应用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）确认 GSDMD 基因（NM_024736）的表达。


RT-qPCR


我们选择了 GSDMD mRNA 引物并在不同浓度下进行了测试。使用 TRIzol 方法，通过 SYBR-Green 和荧光显微镜，使用逆转录试剂盒从子宫内膜癌细胞中提取总 RNA。通过热循环将 GSDMD RNA 反转录为 cDNA：95℃ 变性，60℃ 退火 30 秒，然后在 72℃ 延伸引物模板 1 分钟，共 40 个循环。使用 2-△△cq 方法计算相对基因表达水平。GSDMD siRNA 序列（正向引物，5‘- ACG GGC AGA GGT GGA GAC CAT-3’；反向引物，5‘-ATG GTC TCC ACC TCT GCC CGT-3’）的表达水平通过 GAPDH（正向引物，5‘- TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3’；反向引物，5‘- CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3’）的表达进行标准化。


体内肿瘤发生


4 周龄雌性 SPF 级 BALB/c 裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司下属的上海灵畅生物科技有限公司（自 2019 年 3 月起），许可证号：SCXK（上海）2018-0003，用作人肿瘤异种移植模型；这些裸鼠是纯合突变，无毛且胸腺缺陷，属于 T 淋巴细胞功能障碍动物。方案获得了上海交通大学医学院附属上海市第一人民医院人类研究伦理委员会的批准，参考编号：2019SQ054。我们的研究符合赫尔辛基宣言以及动物护理和使用的机构指南。体重 18-25g 的 BALB/c 小鼠在右肩植入 1x10^7 个 AN3CA-LUC 细胞，在屏障环境下饲养，每只小鼠在独立的通风笼中，温度 22-26°C，湿度 45-65%，12/12 小时光/暗周期（灯光在 08:00 开启）。垫料和饲料每 2-3 天更换一次。当肿瘤直径长到 3 至 4 毫米并可见时，将小鼠随机分为两组：6 只小鼠为富氢水组，浓度为 1.0 ppm（HRW：H1, H2, H3, H4, H5, H6），3 只小鼠为纯化水正常对照组（NC：P1, P2, P3）。小鼠分别通过灌胃给予富氢水或纯水对照（20 mL/kg/d）。我们每天每 2 小时更换一次富氢水，治疗持续 24 天。每 3-4 天测量并记录小鼠体重和肿瘤体积。在实验的第 12、13 和 14 天使用活体成像系统拍摄照片。


我们用过量的 2% 戊巴比妥钠（0.5 mL）麻醉并处死动物，然后使用颈椎脱臼确认死亡。我们从不同组的小鼠中取出子宫内膜癌组织，并如前所述进行免疫组织化学以确定 NLRP3、caspase-1、GSDMD 和 IL-1β 蛋白的表达。所有样本经组织学诊断为子宫内膜癌。


统计分析


使用卡方检验分析组间 IHC 的差异。使用 t 检验、多重 t 检验和通过 Tukey 事后检验进行多重比较的双向方差分析评估 Western Blot、MTT 检测、ROS、线粒体 ROS、PI、TUNEL、RT-PCR、LDH、ELISA、体内肿瘤发生中不同组间的模式差异。P < 0.05 被认为具有统计学显著性。