2.4. 沉积物和水样分析


通过称量沉积物样品在60°C烘干24小时前后的重量测定其含水率。所有水样均经0.2微米滤膜过滤，并于4°C储存直至分析。用于微生物群落分析的沉积物样品在第60天和第90天采集，并于-20°C储存。沉积物和地下水样品中的金属元素经酸消解后使用原子吸收光谱法进行分析。使用pH计测量pH。使用分光光度法测定硫酸盐、硝酸盐和COD。使用带保护阴极的克拉克型氧微电极测量DO。采用1小时HCl提取后接菲洛嗪分析法测定生物可利用的Fe(III)。使用ICP-MS分析水体总溶解铀，铀的检测限为0.001毫克/升。


沉积物样品的含水量通过称重测定，分别在60℃干燥24小时前后进行。所有水样均通过0.2毫米滤膜过滤，并在4℃保存直至分析。用于微生物群落分析的沉积物样品分别于第60天和第90天采集，并保存于20℃。沉积物和地下水样品中的金属元素采用酸消化（HF/高氯酸/硝酸）后进行原子吸收光谱分析（PerkinElmer，PinAAcle 900E，USA）。硫酸盐、硝酸盐和COD采用分光光度法测定（T6系列紫外可见分光光度计，Purkinje General，China）（SEPA ，2002）。pH值使用pH微电极（Unisense AS，Aarhus，Denmark）测定。溶解氧使用带保护阴极的Clarke型氧微电极（Unisense AS，Aarhus，Denmark）测定。生物可利用Fe(III)通过1小时盐酸提取后进行ferrozine分析进行定量。水体总溶解铀采用 ICPMS（Agilent，7700 X，USA）分析，其铀检测限为0.001 mg/L。


2.5. U(VI)和U(IV)的化学萃取


为测定不同时间点吸附态U(VI)和生物成因U(IV)的比例，首先将约0.5克沉积物样品在5毫升100 mM碳酸氢钠溶液中厌氧提取48小时，然后将沉积物-碳酸氢盐浆液置于空气中24小时以使U(IV)氧化为U(VI)。通过这种方式，可以测定沉积物中的总铀、吸附态U(VI)和生物成因U(IV)。


2.6. U L3边XANES测量


荧光U L3边XAFS测量在中国上海同步辐射装置BL14W1光束线进行。所有光谱均在室温下以荧光模式收集。荧光X射线均使用填充有N₂和He气体1:1混合物的电离室监测。该站使用Si(111)双晶单色器来选择能量。测量期间，同步辐射装置运行能量为3.5 GeV。通过同时测量硝酸铀酰光谱，并将其第一拐点定义为17,166 eV，来校准光子能量。沉积物中铀的平均价态可以通过比较其吸收边能量与标准U(VI)和U(IV)的吸收边能量来估算。这种比较称为X射线吸收近边结构分析，使用ATHENA-IFEFFIT软件进行。


2.7. DNA提取、PCR扩增和454钛焦磷酸测序


分别在第60天和第90天从每个添加了电子供体的罐中采集约1克沉积物样品。使用E.Z.N.A.土壤DNA试剂盒提取储存在-20°C的样品以及培养的沉积物样品的群落核酸。使用引物341F和1073R从提取的DNA中扩增16S rRNA基因片段，每个样品使用一个独特的6碱基标签或条形码。每个PCR反应在50 μL反应混合物中进行，包含20 ng DNA、200 μM dNTP、各0.4 μM的引物、1× Pyrobest缓冲液和1.25单位的Pyrobest DNA聚合酶。PCR在ABI GeneAmp®9700上进行，条件如下：94°C 5分钟；94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 30秒，共25个循环；最后72°C延伸7分钟。20 μL PCR混合物包含0.4 μL Fastpfu DNA聚合酶、4 μL 5× FastPfu缓冲液、2 μL dNTPs、各5 μM的引物和10 ng基因组DNA。热循环步骤如下：95°C 2分钟；然后95°C 30秒、55°C 30秒、72°C 30秒，共25个循环；最后72°C延伸5分钟。


表1：实验期间微观体系缩写定义
缩写 缩写定义
E-D 第60天从乙醇添加微观体系采集的沉积物样品。
E-A 第90天从乙醇添加微观体系采集的沉积物样品。
L-D 第60天从乳酸添加微观体系采集的沉积物样品。
L-A 第90天从乳酸添加微观体系采集的沉积物样品。
G-D 第60天从葡萄糖添加微观体系采集的沉积物样品。
G-A 第90天从葡萄糖添加微观体系采集的沉积物样品。
C-A 第90天从未添加电子供体的对照微观体系采集的沉积物样品。
S-B 培养前的原始沉积物样品。

通过琼脂糖凝胶电泳纯化PCR扩增产物，然后使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒回收PCR产物。使用配备PicoGreen® dsDNA定量试剂的QuantiFluor™-ST系统评估PCR扩增产物的浓度和纯度。根据标准方案，在454/Roche GS-FLX Titanium仪器上进行测序反应。在焦磷酸测序中，使用C-A、S-B、E-D、E-A、G-D、G-A、L-D和L-A来代表实验期间来自微观体系的不同沉积物样品。


2.8. 序列分析和分类学分类


使用Seqcln和mothur处理从7个样品获得的序列。去除低质量序列、短于200 bp的序列、含有超过六个核苷酸同聚物的序列以及含有模糊碱基识别或错误引物序列的序列后，总共获得74031条高质量序列，平均每条序列长度为513 bp。为了比较样品的多样性和操作分类单元丰度，将每个样品的序列随机二次采样至6000条，形成每个样品的归一化文库。使用UPARSE流程对归一化的读长进行聚类，相似度超过97%的序列被认为属于同一个OTU。随后，使用UCHIME检测并去除嵌合序列。使用mothur在97%相似性水平上，从归一化文库中确定每个样品的群落丰富度和多样性指数，如香农指数和Ace指数。使用RDP分类器在70%置信阈值下对每个OTU的代表性序列进行系统发育分类。