由于脱氧肌红蛋白向氧合肌红蛋白的转化是铁依赖性的，并可能受细胞氧化还原状态的影响，使用CM-H2DCFDA测量了经过氧气转运测定预处理后选定菌株的氧化还原状态。CM-H2DCFDA产生的荧光强度在氧气转运测定预处理后的酵母菌株之间没有显著差异。这表明在氧气转运测定之前，模拟、HsAQP1、NtPIP1;3和AtPIP1;2菌株中的细胞氧化还原状态相似。与早期报告类似，在NtPIP1;2菌株中检测到过氧化氢通透性增加。然而，在NtPIP1;3、HsAQP1或模拟菌株中未测量到过氧化氢通透性增加，而在AtPIP1;2菌株中观察到略高的荧光强度（提示过氧化氢通透性增加）在统计学上不显著。


酵母氧气消耗能力。异源表达NtPIP1;3和HsAQP1的酵母细胞分别显示出比模拟对照高2.3倍和1.8倍的氧气吸收速率，并且从溶液中消耗氧气的速度显著更快。表达AtPIP1;2的酵母细胞的氧气吸收速率以及从溶液中耗尽氧气的时间与模拟对照相比没有显著差异。异源表达水通道蛋白对酵母细胞直径没有显著影响，在模拟、HsAQP1、NtPIP1;3和AtPIP1;2菌株中测量值分别为2.87±0.05、2.74±0.06、2.98±0.06和2.87±0.08微米（平均值，n=50±标准误）。

图5.酵母菌株在1000秒内的氧气消耗情况。(A)HsAQP1、NtPIP1;3、AtPIP1;2和模拟菌株（对照）的呼吸速率。(B)HsAQP1、NtPIP1;3、AtPIP1;2和模拟菌株（对照）的氧气完全消耗时间。在向经氮气鼓泡的SD-L-U+葡萄糖培养基中的酵母悬浮液供应空气，使其可溶性氧气浓度达到饱和浓度235μmol L-1后，立即使用氧气微传感器监测并每秒记录酵母悬浮液中氧气浓度的下降。星号表示与模拟菌株存在统计学显著差异（下表显示P值）（ANOVA,Tukey检验,P≤0.05,n=6±标准误）。


低氧条件下烟草根中PIP转录丰度和ATP水平。我们检测了在矿物溶液培养中遭受淹水诱导低氧处理两天和七天的烟草植物的转录水平。经过两天低氧处理后，显示高氧气转运速率的水通道蛋白NtPIP1;3在叶片和根中的转录水平比通气良好的植物增加了约四倍。在通气良好的植物中，叶片和根中的水通道蛋白转录水平在第二天和第七天保持相似。在叶片中NtPIP1;4以及根中NtPIP1;1和NtPIP1;2的转录水平也测量到相对较小的增加。七天后，在低氧叶片和根中测量到NtPIP1;3的急剧增加（分别比通气对照高约12倍和22倍）。叶片中NtPIP2;1也有约三倍的增加。在低氧处理下，从第二天到第七天，叶片和根中的NtPIP1;3转录水平急剧增加，同时根尖段的ATP水平显著增加。处理七天后，每个根段中低氧和通气良好的根具有相似的ATP水平。低氧植物外观健康翠绿，没有出现缺氧症或其他可见的氧气缺乏迹象。


讨论


在本研究中，我们通过测量肌红蛋白峰值波长附近吸光度随时间的变化，研究了水通道蛋白对酵母完整细胞和酵母原生质体跨膜氧气转运的潜在贡献。在完整细胞测定中，A541在前60秒内增加，这使我们能够筛选表达推定的氧气转运水通道蛋白的菌株。A541的变化可能代表几个过程的组合，包括氧气扩散、脱氧肌红蛋白的氧合、氧合肌红蛋白和高铁肌红蛋白之间的转化以及氧气消耗。细胞壁的存在可能会阻碍肌红蛋白吸光度的变化，并在初步筛选中导致对氧气扩散的低估。此外，在混合酵母悬浮液和通气缓冲液期间可能会对吸光度读数造成假象。酵母原生质体测定旨在通过众多预防措施和更多重复来消除这些潜在缺陷，并最大化肌红蛋白氧合的信号。结果表明，酵母原生质体测定中的ΔA319/ΔA341也可能是测量氧气通过水通道蛋白转运的高度敏感参数。


我们发现能通过促进氧气通道来增强肌红蛋白氧合的人水通道蛋白HsAQP1，也曾被报道当在非洲爪蟾卵母细胞中异源表达时能促进二氧化碳转运。然而，其他主要的二氧化碳转运水通道蛋白，包括AtPIP1;2、NtPIP1;2和LbAQP1，在酵母中表达时并未促进氧气转运。这表明水通道蛋白直系同源物已经发展出一定程度的氧气转运特异性。对所有分析的20种水通道蛋白的比对并未显示氧气转运水通道蛋白独有的共有残基。看来保守残基是物种依赖性的，而非与转运能力相关。然而，值得注意的是，所有六种氧气转运水通道蛋白在物种间具有高度保守的29个氨基酸残基，包括大多数Asn-Pro-Ala签名基序和Ar/R选择性过滤器的残基。在NtPIP1;3中，通常位于第二个NPA基序中的天冬酰胺残基被苏氨酸（Thr-235）取代，这可能与其高度增强的氧气转运能力潜在相关。


对疏水气体（氧气、二氧化碳和一氧化氮）渗透的计算一致显示通过水孔的能量屏障值相似，为5-6千卡每摩尔。人类HsAQP1四聚体的膜蛋白模拟系统证明了在四个单体之间中心存在一个孔，该孔主要由疏水残基排列，可能参与气体而非水的转运。可以推测，该孔的存在及其精确结构赋予了不同水通道蛋白气体转运特异性。如果证明正确，该孔的门控特性可以作为靶点来改变跨膜气体通过的速率。


酵母氧气吸收速率的结果证实了氧气转运测定的结果，指出了孔介导的转运对呼吸作用的重要性。癌细胞中经常报道HsAQP1转录水平增加，有时也伴随其他水通道蛋白的增加，HsAQP1的表达水平通常与细胞生长、肿瘤分级和转移相关。也有报道称，删除HsAQP1能有效减小乳腺肿瘤大小和肺转移，并且HsAQP1沉默抑制了骨肉瘤细胞的增殖和侵袭性。虽然对HsAQP1表达与癌性生长之间联系提出的解释主要集中在水转运上，但也应考虑快速生长的癌细胞对氧气的高需求与HsAQP1促进氧气转运之间的关联。

图6.暴露于通气良好和低氧条件后，烟草质膜内在蛋白的转录丰度。(A)暴露2天后叶片中和(B)根中，以及(C)暴露7天后叶片中和(D)根中所选PIPs的相对转录丰度。PIPs的转录丰度通过qRT-PCR分析中的标准曲线法测定，并针对两个参考基因EF1-α和L25转录丰度的几何平均值进行标准化。星号表示同一天通气良好与低氧处理之间基因表达的显著差异；下表列出了第2天与第7天之间比较的P值（ANOVA,Tukey检验,P≤0.05,n=6±标准误）。

图7.遭受低氧和通气良好条件的烟草植株叶片以及根基部、根中部和根尖段的ATP水平。(A)处理2天后的ATP水平。(B)处理7天后的ATP水平。ATP水平通过检测萤光素酶/萤光素反应中的生物发光信号来确定。星号表示同一天同一组织中通气良好与低氧处理之间ATP水平的显著差异；下表列出了第2天与第7天之间比较的P值（ANOVA,Tukey检验,P≤0.05,n=6±标准误）。


由于关于低氧诱导HsAQP1表达的报道表明水通道蛋白介导的转运过程在低氧条件下可能特别重要，我们检测了烟草的转录水平。低氧导致七天后低氧和通气良好植物的叶片和所有根段中ATP水平相似。结果表明，在经历初始低氧胁迫后，植物可能获得了足够的氧气来支持有氧呼吸，因为低氧植物外观健康翠绿，并且没有表现出缺氧症或其他可见的氧气缺乏迹象。虽然某些植物对根低氧的抵抗可以通过形成特殊的通气结构（如通气组织）来增加向根细胞的氧气供应来解释，但在没有明显结构变化的情况下植物对低氧抵抗的过程仍然不清楚。在我们的研究中，暴露于根低氧的植物根和茎中没有出现可指示改善氧气输送的结构特征。因此，NtPIP1;3转录水平的增加可能是促进根通气的重要因素之一，类似于低氧人体组织中HsAQP1转录水平的增加。显然，孔介导的氧气转运与低氧之间的联系值得进一步关注。


总之，我们的结果表明，所研究的一些植物和人类水通道蛋白可能参与氧气转运。异源表达这些水通道蛋白的酵母细胞在液体培养中保持了更高的氧气吸收速率，并且烟草植物在其根遭受低氧条件后，推定的氧气转运水通道蛋白急剧增加。这些氧气转运水通道蛋白在七天低氧处理后的增加伴随着低氧根尖段ATP水平的增加。研究结果支持了孔介导的氧气转运的功能意义应受到更多关注的观点。