讨论


本研究调查了与固定化在钙藻酸盐珠中的乳酸乳球菌亚种lactis NCIMB 6681生长和释放相关的现象。根据先前研究，乳酸在珠内部积累随着固定化乳酸菌生长。这种积累导致珠内部pH降低，结合高浓度未解离乳酸，最终抑制珠内部生长。在本研究中，这种发展通过连续发酵珠的生物量分布分析证明，因为珠内部浓度在初始发酵期后保持不变。在珠外围，高生物量浓度在连续发酵前12小时内似乎稳定。在珠表面附近约150μm厚的层中测量到70 g干重l⁻¹的生物量浓度。这些值略低于报道的值在研究固定化在钙藻酸盐珠中的L.lactis亚种lactis bv.diacetylactis时。然而，在本研究中，珠的较大部分可能已在每层溶解。数学模拟表明极高浓度的生物量位于珠表面附近非常窄的层中。如果珠的较大部分被溶解，高浓度区域可能已与珠内部较少生物量密度的区域平均。这可能解释了本研究中观察到的值与先前报道值之间的差异。


珠表面附近的生物量浓度似乎随连续发酵延长而稳定。比较连续发酵12和48小时的珠，最外层生物量浓度未观察到变化。这些观察与报道的观察和模拟一致。不同尺寸珠的连续发酵实验结果表明大多数生长和乳酸生产发生在珠表面附近狭窄范围内。此区域和珠整体似乎达到稳态生物量浓度。这些观察表明，当生长发生时，过量生物量释放到周围介质中。这种自由细胞释放可能可取或不可取。已提出几种方法来减少乳酸菌从藻酸盐珠释放。一种方法是在发酵前用蒸馏水、乙醇、Al(NO₂)或热CaCl₂溶液冲洗包含固定化乳酸菌的藻酸盐珠以杀死珠表面附近细菌。另一种方法是应用多層聚L-赖氨酸和藻酸盐涂层，将细胞释放减少10倍。还有一种方法研究了使用壳聚糖减少细胞释放。报道在重复2小时牛奶发酵中，壳聚糖涂层藻酸盐珠的自由细胞数量比未涂层珠减少。先前研究了顺序涂层壳聚糖和藻酸盐的使用，在整个调查的48小时连续发酵期间减少了体积基准细胞释放速率。本研究调查了利用扩散限制和相应的固定化生长乳酸菌珠内pH梯度来影响固定化细胞发展及其伴随释放的可能性。


乳酸菌的生长速率取决于生长介质中的pH值。测定pH 6.5是自由悬浮L.lactis亚种lactis NCIMB 6681在此培养基中的最适生长pH。当pH升高above 7.5时生长速率迅速下降，在pH 9.00未观察到生长。在固定化L.lactis亚种lactis发酵中将控制pH从6.50调整到9.25导致细胞释放速率与乳酸生产速率的比值初始减少约10倍，相比在细菌生长最适pH下运行的发酵。这种发酵pH改变显然改变了内部pH梯度和L.lactis亚种lactis在珠内的分布模式。从图7可见，在发酵24小时后测量的珠最外部pH梯度剖面在pH 9.00和9.25下发酵的珠中有显著差异。在pH 9.25下发酵的珠中，珠最外部0.4 mm内pH仅轻微降低，而pH梯度在pH 9.00下发酵的珠内似乎下降更迅速。在pH 9.25下发酵的珠最外部观察到的表观pH阈值层与生物活性小的层一致，因为此层局部pH above 9.00。在此pH下未观察到自由悬浮L.lactis亚种lactis NCIMB 6681生长。生物量分布分析和不同尺寸珠发酵结果表明大多数生长和乳酸生产发生在珠表面附近当发酵在正常pH下进行时。因此，释放细胞只需破裂很少凝胶。增加pH似乎将生长最适pH区移向珠中心，远离表面。如果生长发生在珠内部，释放细胞必须破裂更多凝胶材料。这种机制可能解释了在pH 9.25下运行的发酵中观察到的减少细胞释放速率。


事实上，视觉检查在pH 9.25下连续发酵46小时的珠确实揭示了表面下包含大量松散结合生物量的层。固定化细菌的强烈生长似乎削弱了此区域的藻酸盐凝胶。藻酸盐凝胶层位于此层外部，有效阻挡了下层生物量的释放。这种情况可能与用额外无细胞藻酸盐层涂层珠的发酵甚至藻酸盐胶囊相比。几位作者报告了使用额外无细胞藻酸盐层涂层珠减少细胞释放。Klinkenberg等人也研究了从包含固定化L.lactis亚种lactis的藻酸盐涂层藻酸盐珠的细胞释放在连续发酵中。在那项研究中，细胞释放速率与乳酸生产速率的比值显著减少在整个48小时发酵期间明显。然而，那些发酵早期阶段观察到的效果不如本研究中观察到的那么大。


我们的结果表明，可以选择狭窄的操作pH窗口，促进细胞释放减少和珠内生物量分布变化。这种效应已在几个实验系列中证明，尽管pH测量和控制的变异以及窗口的狭窄给出了效果出现的确切pH值略有不同。发酵介质pH必须控制的方式使得生长速率在自由介质以及珠外围严重抑制，而生长可能在珠内部受pH梯度保护继续。当介质pH首次增加时，观察到细胞释放速率的初始减少。此初始期可能对导致长期减少细胞释放的过程关键。生长和乳酸生产在pH增加时同时减少。由于珠内部产生的乳酸必须扩散出来，珠内部pH降低。这可能保护此区域细胞并允许继续生长。然而，如果pH增加太高或突然，乳酸生产也将被抑制，保护性pH梯度将消失。如果pH增加太小，外围细胞生长将暂时抑制，但内部和表面乳酸生产可能降低局部pH足够恢复外部区域生长和乳酸生产。在此提出的实验中，在达到选定操作pH前应用了短保持期在pH 6.50下2小时，然后进行单步改变。其他程序可能可行，例如一系列逐步改变以达到操作pH，这可能扩展此pH窗口以产生此处为pH 9.25案例看到的效果。


然而，特殊生长条件的要求可能在某些食品应用中排除这种减少细胞释放的方法。但是，其他可能应用现在可能由于这种扩展的pH操作范围而可用。先前已报告固定化乳酸菌在短时间暴露于极端pH值后可以维持高活性。从图3、5和7的一个有趣观察是，高细胞释放和乳酸生产速率维持在通常会导致自由细胞培养生长速率严重抑制的pH值。在pH值above 8.5时，自由细胞培养中的生长速率可忽略，而细胞释放速率和乳酸生产速率在固定化发酵中未显著影响。事实上，似乎在pH 8.50、8.75和9.00下实现的稳态乳酸生产速率和内部细胞密度大于在pH 6.50下实现的值。这些差异出现即使自由细胞生长应在此贡献在pH 6.50下测量的细胞释放速率。在pH 6.50下约18-22%的自由细胞源自反应器中自由细胞生长。在pH值above 8.5时，自由细胞生长可能不显著贡献总自由细胞浓度由于发酵broth中的恶劣条件。因此，可能利用扩散限制与伴随的pH梯度来应用固定化发酵于涉及恶劣条件的工艺，这些条件对固定化生物量提供一定保护和稳定效果，但有效防止污染生物生长。


结论


本研究证明了通过控制外部pH值可以显著影响固定化乳酸乳球菌在藻酸盐珠中的分布和释放行为。将发酵pH从6.5提升至9.25能够：


•将细胞释放速率与乳酸生产速率的比值降低近10倍


•使珠内生物量浓度提高5倍


•将乳酸生产速率提升25%


这些发现表明，通过利用固定化系统内产生的pH梯度，可以创造有利于珠内部生长而不利于珠外围生长的条件，从而有效控制细胞释放。这种方法不仅为减少细胞释放提供了新策略，还扩展了固定化细胞技术在恶劣pH条件下的应用潜力，为生物工艺设计提供了重要见解。