钙藻酸盐珠内生物量分布分析


钙藻酸盐珠内生物量分布分析按所述方法进行。珠内生物量浓度测定通过将藻酸盐珠溶解在1%柠檬酸钠溶液中实现。定期收集液相并用新鲜柠檬酸钠溶液替换。细胞密度如上所述测定。在此分析前后珠尺寸用卡尺测量，在氯化钠和氯化钙溶液中孵育5小时后。每种类型50个珠被测量以获得足够准确性。


藻酸盐珠内pH梯度测量


包含固定化L.lactis亚种lactis的藻酸盐珠从反应器中取样，并立即置于包含从反应器流出物获得的介质的腔室中。流出物离心以去除自由细胞，介质pH在这些测量前控制。测量腔室温度通过循环介质通过恒温水浴控制在30°C，使用蠕动泵。此再循环环还提供剧烈搅拌以最小化外部质量传递限制。测量使用pH微电极进行，连接到手动微操纵器。微操纵器提供连续横向移动定位，最小校准单位相当于20μm，尖端在立体显微镜观察下定位。参考电极置于周围介质中。使用的pH电极尖端直径为15μm。pH微电极在三个不同pH值校准，测量的mV响应与pH的关系通过线性回归建立。


乳酸浓度测定


乳酸浓度在发酵期间间隔测定。样品加入冷高氯酸中，离心并通过0.2-μm注射器过滤器过滤后进行HPLC分析。使用色谱仪，配备自动进样器，使用Aminex HPX-87-H柱在45°C和RI检测器。作为洗脱液，使用5 mmol l⁻¹H₂SO₄。商业标准用于校准。


结果


藻酸盐珠中包含乳酸乳球菌亚种lactis的生物量和活性分布


固定化细菌从钙藻酸盐珠的释放与细菌在珠中的生长相关。随着细菌生长，珠中生物量分布发生变化。为了研究这些变化，包含固定化L.lactis亚种lactis NCIMB 6681的珠在控制pH 6.5下连续发酵，并在不同发酵时间收获进行生物量分布分析。珠在开始和连续发酵5.5、12和48小时后的生物量分布如图1所示。

最初，珠包含均匀分布的生物量。在连续发酵的前12小时内，生物量分布发生变化，因为珠最外层的生物量浓度比珠中心增加更多。发酵12小时后，珠最外层约150μm厚的层包含约73%的生物量。生物量浓度似乎不随发酵延长在此层进一步增加。在连续发酵48小时后分析的珠中，约73%的生物量位于珠最外层180μm内。然而，在珠较深层也观察到生物量浓度的轻微增加。在珠中心，生物量浓度在5.5至48小时发酵期间未观察到变化。


生物量的代谢活性及其在珠内的分布通过监测乳酸生产速率进行研究。使用直径在1.4至3.5 mm之间的各种珠以研究珠尺寸对乳酸生产速率的影响。这些珠在pH 6.5下连续发酵48小时。在初始增加后，乳酸生产速率稳定。稳定后的乳酸生产速率如图2所示，并表示为每种珠尺寸的乳酸生产速率与3.3 mm珠的乳酸生产速率的比值。每个速率基于总珠体积和总珠表面积呈现。较小直径的珠似乎具有比较大的直径珠更大的体积基准乳酸生产速率。记录的1.4 mm珠的体积基准乳酸生产速率比3.3 mm珠观察到的速率大90%以上。

然而，如果乳酸生产速率基于表面积而不是总体积计算，则观察到较小差异。记录的基于珠表面积的1.4 mm珠乳酸生产速率仅比参考珠观察到的速率低14%。如图2模拟所示，这些观察与假设一致，即主要位于珠表面附近的细胞贡献乳酸生产。


pH依赖性固定化乳酸乳球菌亚种lactis的性能


由于乳酸菌的生长伴随乳酸生产，不同尺寸珠的结果表明大多数乳酸菌生长位于珠最外部。由于珠最外层生物量浓度似乎稳定，该区域的生物量生长可能释放到周围介质中。根据先前研究，珠内部生物量被未解离乳酸和低pH抑制。因此，升高周围介质pH可能用于影响珠内生物量分布和随后细胞释放，通过促进珠内部生长和抑制外围生长。为了研究这个想法，记录了L.lactis亚种lactis在给定培养基中不同控制pH值下的生长速率。基于这些实验，在固定化细菌连续发酵实验中使用以下pH值：6.5、8.50、8.75、9.00和9.25。所有发酵在发酵前2小时在pH 6.5下运行，以在珠中建立保护性pH梯度。细胞释放速率，监测为自由细胞生产速率，在发酵期间各种间隔测定。每个发酵的自由细胞生产速率如图3所示。

珠内生物量浓度和流出物中乳酸浓度在同一间隔测定。珠内细胞密度在发酵期间的时间过程如图4所示，而观察到的乳酸生产速率如图5所示。

为了确定观察到的细胞释放减少是否实际由于减少细胞释放而非仅代谢活性降低的后果，细胞释放速率与乳酸生产速率的比值在发酵期间间隔如图6所示。

藻酸盐珠内pH梯度在发酵22小时于pH 6.50、9.00和9.25后如图7所示。


细胞释放速率在发酵早期阶段增加。在pH 6.50下运行的发酵在连续发酵12-15小时后达到稳态细胞释放速率。在接下来33小时发酵期间仅观察到细胞释放速率的微小变化。这与连续发酵期间内部生物量分布分析结果一致。


随着pH增加，观察到细胞释放速率的变化。然而，所有发酵，除了在pH 9.25下操作的发酵，在24小时内达到与在pH 6.50下运行的发酵相似的稳态细胞释放速率。在pH 9.25下运行的发酵中，随着pH改变，观察到细胞释放速率的初始急剧下降，导致细胞释放速率比其他发酵的稳态水平降低10倍。在发酵剩余期间，细胞释放速率稳定增加，但未看到稳态。发酵48小时后，细胞释放速率仍比在较低pH下发酵的稳态细胞释放速率低约10倍。


周围介质的改变条件也影响了发酵期间珠中生物量浓度的过程。在pH 6.5、8.5、8.75和9.00下发酵的珠中生物量浓度在连续发酵24小时内达到稳态值。然而，在pH 9.25下发酵的珠中生物量从未在48小时发酵内达到稳态浓度。尽管周围介质pH增加减缓了内部生物量浓度的初始增加，这些珠达到了生物量浓度约五倍于在pH 6.5、8.5、8.75和9.0下发酵的其他珠观察到的稳态生物量浓度。周围介质的改变pH似乎也影响了乳酸生产速率。在pH 9.25下运行的发酵中乳酸生产速率在发酵早期阶段不像其他发酵那样增加，但与其他发酵相反，它在整个48小时发酵期间持续增加。在发酵结束时，在pH 9.25下运行的发酵中观察到乳酸生产速率增加25%，相比其他发酵，尽管细胞释放速率仍相对低一个数量级。


这些大变化背后的机制假定与珠内pH梯度差异相关。从图7可见，在pH 9.00和9.25下发酵22小时的珠最外部pH梯度有显著差异。在珠内部，局部pH似乎差异较小。尽管在高pH下发酵的珠中pH梯度更陡，但在高pH下发酵的珠中心局部pH仅比在pH 6.5下发酵的珠高1.7单位。


因此，从图6和图7可见，可以改变介质外部pH，使得生长在周围介质和珠外围不利，而生长和乳酸生产在珠内部继续。这种情况改变了细胞释放速率与乳酸生产速率的比值，导致产物流包含更少自由细胞。这些实验也说明，从图7和图8可见，固定化由于扩散限制和伴随的珠内pH梯度导致pH操作范围的大偏移。


这些数据表明固定化细胞可以成功应用于基于在pH耐受性极端上限操作的应用。