3.2.CBS和CSE产生的H2S抑制胎盘中sFlt-1生产


我们之前的研究显示，H2S供体NaHS和前体L-半胱氨酸抑制培养外植体中sFlt-1释放。鉴于sFlt-1主要由胎盘合胞体滋养层细胞合成和分泌，我们调查了H2S对培养合胞体滋养层细胞中sFlt-1生产的影响。如图3A&B所示，用H2S供体NaHS（1-8 x 10^-5 M）和H2S前体L-半胱氨酸（0.25-2 x 10^-3 M）处理培养合胞体滋养层细胞，导致sFlt-1蛋白释放和mRNA表达剂量依赖性减少。

图3. 硫化氢调节人胎盘细胞中sFlt-1的产生。A&B，硫氢化钠和L-半胱氨酸对培养胎盘细胞中sFlt-1产生的影响。细胞用不同浓度的硫氢化钠和L-半胱氨酸处理24小时。通过 ELISA 检测培养基中sFlt-1的蛋白水平。通过实时RT-PCR测定细胞中sFlt-1的mRNA水平。C，L-半胱氨酸对CBS或CSE敲低细胞中sFlt-1产生的影响。细胞转染对照siRNA、CBS siRNA或CSE siRNA后，用L-半胱氨酸（2×10³ M）处理24小时。通过 ELISA 检测培养基中sFlt-1的蛋白水平。数据以均值±标准误表示（n ¼ 4个培养物）。*P < 0.05，**P < 0.01 vs 载体对照或指定。

我们然后使用siRNA方法调查了CBS和CSE是否贡献L-半胱氨酸对胎盘细胞中sFlt-1生产的影响。首先，我们确认了培养合胞体滋养层细胞能够产生H2S，并且H2S生产率在存在CSE抑制剂PAG或CBS抑制剂AOAA时被抑制。然后，我们显示L-半胱氨酸（2 x 10^-3 M）处理在转染CSE siRNA或CBS siRNA的细胞中不能抑制sFlt-1生产（图3C）。


3.3.MiR133b参与H2S对sFlt-1的效应


由于H2S抑制sFlt-1转录水平，我们然后通过评估sFlt-1 mRNA的半衰期检查H2S是否影响sFlt-1 mRNA稳定性。如图4A&B所示，在存在mRNA合成抑制剂DRB（2.5 x 10^-5 M）的情况下，NaHS和L-半胱氨酸降低了sFlt-1 mRNA的半衰期。

图5. 可溶性Flt-1是miR-133b的直接靶标。A，miR-133b模拟物对胎盘细胞中sFlt-1基础水平的影响。细胞经miR-133b模拟物处理24小时后，分别通过实时RT-PCR和 ELISA 检测细胞内sFlt-1的mRNA水平及培养基中sFlt-1的蛋白浓度。B，miR-133b抑制剂对胎盘滋养层细胞中sFlt-1基础水平的影响。细胞经miR-133b抑制剂处理24小时后。C，sFlt-1基因30个非翻译区（UTR）中预测的miR-133b靶序列及其突变核苷酸。D，含sFlt-1基因30个UTR及其突变核苷酸的报告基因荧光素酶活性检测。胎盘滋养层细胞转染上述报告基因后，分别在有无miR-133b模拟物的条件下进行检测。使用双荧光素酶报告基因检测系统测定细胞裂解液中的荧光素酶活性。数据以均值±标准误表示（n ¼ 4组培养）。*P < 0.05，**P < 0.01 vs 载体对照组。

MiR可以通过其种子序列（5'端核苷酸2-8）与互补位点结合来降解mRNA靶点。生物信息学分析显示，靶向sFlt-1的miR包括miR-133b、-182和-190。先前研究报道了先兆子痫胎盘中miR133b的变化。如图4C&D所示，NaHS（2-8 x 10^-5 M）和L-半胱氨酸（0.5-2 x 10^-3 M）以剂量依赖性方式增强胎盘滋养层细胞中miR-133b表达。


我们然后通过使用这些miR的模拟物和抑制剂以及sFlt-1-3'-UTR-荧光素酶报告assay确认sFlt-1是miR-133b的直接靶点。如图5A&B所示，转染miR-133b模拟物导致sFlt-1 mRNA表达和sFlt-1蛋白释放减少，而miR-133b抑制剂增加细胞中sFlt-1 mRNA水平和蛋白释放。荧光素酶报告assay确认miR-133b靶向sFlt-1（图5C&D）。

图5. 可溶性Flt-1是miR-133b的直接靶标。A，miR-133b模拟物对胎盘细胞中sFlt-1基础水平的影响。细胞经miR-133b模拟物处理24小时后，分别通过实时RT-PCR和 ELISA 检测细胞内sFlt-1的mRNA水平及培养基中sFlt-1的蛋白浓度。B，miR-133b抑制剂对胎盘滋养层细胞中sFlt-1基础水平的影响。细胞经miR-133b抑制剂处理24小时后。C，sFlt-1基因30个非翻译区（UTR）中预测的miR-133b靶序列及其突变核苷酸。D，含sFlt-1基因30个UTR及其突变核苷酸的报告基因荧光素酶活性检测。胎盘滋养层细胞转染上述报告基因后，分别在有无miR-133b模拟物的条件下进行检测。使用双荧光素酶报告基因检测系统测定细胞裂解液中的荧光素酶活性。数据以均值±标准误表示（n ¼ 4组培养）。*P < 0.05，**P < 0.01 vs 载体对照组。

3.4.MiR-133b在先兆子痫胎盘中下调


如图6所示，先兆子痫胎盘中miR-133b水平显著低于正常胎盘（P<0.01）。miR-133b水平与CSE和CBS表达相关（P<0.05）。

图6. 正常与子痫前期胎盘中miR-133b的表达水平及其与CBS或CSE水平的相关性分析。A、正常胎盘（n ¼ 23）与子痫前期胎盘（n ¼ 19）中miR-133b的表达情况。B、胎盘中CBS与miR-133b水平的相关性分析。C、CSE表达与miR-133b表达的相关性分析。数据以均值±标准误表示。*P<0.05，**P<0.01。PE：子痫前期。

4.讨论


本研究证明，H2S合成酶CBS、CSE和3-MST在人胎盘合胞体滋养层细胞中有表达。CSE和CSE产生的H2S抑制合胞体滋养层细胞中sFlt-1生产，且H2S的该效应依赖于miR-133b的表达。


3-MST被报道能够在大脑和血管内皮中从L-半胱氨酸生成H2S。本研究首次显示3-MST在人胎盘中有表达，并主要定位在合胞体滋养层细胞。如所述，关于胎盘中CSE和CSE定位可能存在争议。Cindrova-Davies等人证明CBS主要定位在合胞体滋养层细胞，而CSE定位在动脉平滑肌细胞。Wang等人显示CSE定位在合胞体滋养层和内皮。相反，Holwerda等人报道CBS和CSE蛋白在胎儿-胎盘内皮中表达。这种差异可能由于个别组使用的CSE和CSE抗体来自不同公司。为了确认胎盘中CSE和CSE定位，本研究使用了来自两个公司的CBS和CSE抗体。我们的结果证明，由任一抗体识别的CSE和CSE阳性3-MST已被报道能够在大脑和血管内皮中从L-半胱氨酸生成H2S。本研究首次显示3-MST在人胎盘中有表达，并主要定位在合胞体滋养层细胞。如所述，关于胎盘中CSE和CBS定位可能存在争议。Cindrova-Davies等人证明CBS主要定位在合胞体滋养层细胞，而CSE定位在动脉平滑肌细胞。Wang等人显示CSE定位在合胞体滋养层和内皮。相反，Holwerda等人报道CBS和CSE蛋白在胎儿-胎盘内皮中表达。这种差异可能由于个别组使用的CSE和CBS抗体来自不同公司。为了确认胎盘中CSE和CBS定位，本研究使用了来自两个公司的CBS和CSE抗体。我们的结果证明，由任一抗体识别的CSE和CBS阳性染色在合胞体滋养层和内皮中被鉴定。


我们之前的研究已证明，H2S对胎盘细胞中sFlt-1释放的抑制与Flt-1脱落过程的抑制相关。在本研究中，我们显示CSE和CBS负责内源性H2S对胎盘细胞中sFlt-1释放和mRNA表达的抑制。此外，我们还发现H2S通过降低sFlt-1 mRNA稳定性来减少sFlt-1转录本，表明H2S对sFlt-1生产的调节可在转录后水平发生。鉴于miR可通过结合不完全配对来降解mRNA靶点，且我们之前研究已显示H2S可影响胎盘细胞中靶向VEGF的miR表达，我们探讨了H2S是否影响靶向sFlt-1的miR表达。发现H2S增强了靶向sFlt-1 mRNA的miR-133b表达，表明调节miR-133b表达是H2S抑制胎盘中sFlt-1生产的机制之一。


越来越多的证据表明，胎盘中sFlt-1生产增加在先兆子痫的发展和进展中起重要作用。然而，胎盘中sFlt-1生产增加的机制仍largely未知。我们的研究证明，通过CSE和CBS产生的内源性H2S是胎盘中sFlt-1生产调节的重要负性因子。此外，我们还发现胎盘中CSE和CBS表达水平与sFlt-1表达显著相关。鉴于CSE和CBS表达在先兆子痫胎盘中被下调，表明CSE和CBS功能障碍可能至少部分导致先兆子痫患者循环中sFlt-1水平升高。


我们之前研究已显示H2S抑制靶向VEGF的miR表达。相反，本研究显示H2S增强了miR-133b表达。本研究的局限性在于未回答H2S对不同miR产生相反效应的分子基础。H2S已被涉及诱导各种蛋白质中半胱氨酸残基的S-硫水化和二硫键。因此，研究H2S是否诱导负责调节不同miR表达的蛋白质功能变化是很有意义的。


5.结论


我们的结果表明，通过CSE和CBS产生的H2S在调节人胎盘中sFlt-1生产中起关键作用。胎盘中CSE和CBS表达减少可能有助于先兆子痫胎盘中sFlt-1生产升高。