体内癌症饥饿疗法

图5 MS NP介导的体内肿瘤饥饿疗法。


然后，在双侧4T1异种移植肿瘤小鼠身上评估了MS NPs作为体内DOA用于肿瘤饥饿疗法的潜在资格，在右侧肿瘤内注射MS NPs，在左侧肿瘤内注射生理盐水作为对照。通过多波长光声(PA)和B型超声(US)图像的联合注册，实时定量监测瘤内血氧饱和度(sO2)的变化，即血红蛋白结合氧的水平。对照组的sO2值几乎保持不变，约为37%，与注射前持平(图5a,c)，这证实了4T1实体瘤在此期间的轻微缺氧性质，以及生理盐水本身对瘤内sO2的影响微乎其微。值得注意的是，从注射MS NPs十分钟后开始，sO2就急剧下降，这种下降趋势一直持续到三小时，瘤内血氧几乎被完全清除(图5b、c)，这表明HbO2被有效脱氧。同时，金标准氧微电极显示，肿瘤组织中溶解的游离氧也同样被彻底清除(图5d、e)。瘤内溶解氧原始微轮廓的明显波动表明，实体瘤中的氧分布是不均匀的，而在注射MSNP后，这种不均匀性被大幅消除，达到了持久的零氧张力。从理论上讲，细胞生长的有利微环境主要依赖于血红蛋白结合氧和组织内溶解氧之间的平衡，因此肿瘤内这两种氧的完全耗竭将不可避免地导致严重缺氧以及随后的细胞坏死和凋亡。


此外，还进行了体内18F-MISOPET/CT成像，以评估瘤内缺氧水平和非肿瘤区域的潜在误缺氧。与PA/US结果一致，早期PET/CT图像显示治疗前的缺氧水平相当，这证实了双侧肿瘤在这一阶段的轻微缺氧性质(图5f)。尽管18F-MISO放射性在体内不可避免地会发生核衰变和新陈代谢损失，但在注射MSNP一小时后的PET/CT图像中，仍观察到18F-MISO摄取大大增强(图5f、g)。更令人兴奋的是，在三小时后的PET/CT图像中，发现缺氧区域覆盖了整个肿瘤区域，而肿瘤周围的正常组织中没有发现任何新产生的缺氧区域。作为阴性对照，皮下注射MS NPs后，正常组织的血液sO2和氧张力没有明显变化，这进一步证实了MS NPs在体内的酸性敏感性和特异性，从而消除了对正常pH值的非癌组织的潜在副作用的担忧。


令人兴奋的是，与仅注射生理盐水的对照组相比，DOA饥饿的肿瘤生长速度要慢得多，这证实了瘤体内(i.t.)给药MS NPs是一种高效的肿瘤生长抑制剂，而且在主要器官组织中检测不到毒性(图5h)。重要的是，瘤内过氧化氢也同时被消耗掉了。此外，与广泛报道的缺氧诱导p53积累的情况一致，通过这种外源脱氧，HIF-1α也被发现显著上调，从而使肿瘤中的p53凋亡通路恢复活力(图5i、j)，进而导致癌细胞快速凋亡。不出所料，除了体内显示的直接缺氧诱导的线粒体损伤外，病理血沉和伊红(H&E)染色检测也显示，DOA饥饿的肿瘤在一小时后出现明显的纤维化、坏死和凋亡，这种损伤在24小时后变得更加严重(图5k)。


MS NPs在体内脱氧过程中的演变

图6 MS NPs在体内癌症饥饿治疗过程中的演变。


为深入理解这种DOA诱导的癌症饥饿疗法，我们进一步研究了肿瘤内MS纳米颗粒的时间动态演变。与体外实验结果一致，硅元素在肿瘤中被滞留并逐渐降解，而镁元素则快速排出（图6a）。通过激光解吸电离质谱（LD-IMS）扫描的硅镁比分布图显示了肿瘤内硅镁的相对分布（图6b）。在部分注射MS纳米颗粒0.5小时后，观察到硅镁比约为0.8的均匀分布，证实了其在高肿瘤间质液压力下仍能快速渗透44。随后，富含硅的微团块呈现色差特征并逐渐增大，同时硅镁比整体升高（补充图25）。由于肿瘤酸性存在高度异质性45，硅镁比较高的区域被视为酸性更强的区域。值得庆幸的是，这种非均匀酸性分布并未导致氧耗尽的异质性，这一点从全肿瘤范围的显著耗氧和缺氧生成现象中得到印证（图5b，d–f）。


从更微观的角度来看，时间序列TEM图像和电子能损耗谱(EELS)显示，瘤内Mg2Si晶体纳米颗粒逐步转变为无定形微片。这种转变伴随着显著的氧捕获和镁消除，更明显的是，硅的价态从-4急剧逆转为+4(图6c-i)。根据29Si固态魔角旋转核磁共振(MASNMR)结果(图6j)，发现最初的脱氧产物是不饱和HxSi(OSi)4-x物种，即包裹结晶MSNP的无定形物质(图6d)。正如定义明确的Q2和Q3物种所示，这些中间产物被进一步氧化并凝结成富含硅醇基团的SiO2微片。这一发现显然证实了组织内SiO2微片形成的温和、逐步脱水-缩合机制，从而使这些动态生成的聚集体成为有效的肿瘤毛细血管阻断剂，阻止红细胞的循环。


此外，还使用Magnevist作为T1对比剂，对双侧4T1肿瘤小鼠进行快速扫描磁共振成像(MRI)，以估计瘤内血管的通透性。注射了生理盐水的左侧肿瘤在五分钟内迅速变亮，相比之下，注射了MSNP的右侧肿瘤的信号增强要慢得多(图6k、l)，这证实了原位形成的二氧化硅微片大大降低了肿瘤血管的通透性。血管通透性在很大程度上受到抑制，阻碍了血氧的进一步供应，从而导致瘤内长期缺氧。此外，注射外源二氧化硅微片后，发现没有血栓形成现象，也没有观察到明显的肿瘤生长抑制，因为它们更不可能渗透到毛细血管中。


更有趣的是，这些缓慢凝结的二氧化硅微片被发现逐渐降解成小分子硅酸，在晚期具有可识别的Q1和Q2种类(图6j)，这也是它们在肿瘤中大约七天内完全消失的原因(图6a。幸运的是，在此之后，肿瘤仍然保持着严重的缺氧状态，这可能是由于缺氧引起的肿瘤血管损伤，主要是瘤内血管内皮细胞的凋亡/坏死。


总之，我们展示了一项概念验证研究，即PVP改性Mg2Si纳米粒子可用作饥饿肿瘤的DOA。这些纳米粒子能在酸性肿瘤微环境中有效消耗瘤内氧。此外，无定形的二氧化硅微沉积物副产品可以阻塞肿瘤毛细血管，在降解前阻止再吸氧。在临床转化方面，对静脉注射进行了评估。尽管纳米粒子具有生物相容性，但这种注射途径只能轻微改善肿瘤缺氧，因此抑制肿瘤的效果较差。我们的研究结果表明，除了传统的抗血管生成疗法外，使用纳米氧化亚氮进行肿瘤内脱氧也是一种很有前景的癌症饥饿疗法。还需要进一步研究纳米粒子的表面修饰，以实现更长的血管循环，从而实现有针对性的肿瘤积聚。