3.2 H2-MBs可以通过超声成像可视化。


由于MBs是增强超声成像最常用的对比剂，因此检查了H2-MBs在体外和大鼠心脏中的成像效果。结果表明，H2-MBs引起了有效的超声回波响应，超声信号的强度与浓度成正比（图2a）。定量分析显示，超声信号的强度分别为1×105、1×106、1×107、1×108和1×109个H2-MBs/mL时分别为43.01±1.29、57.86±1.45、88.29±0.76、114.68±0.74和161.04±1.48 dB（图2b）。此外，还比较了大鼠心脏左心室（LV）注射H2-MBs前后的成像效果，结果显示注射H2-MBs后超声信号显著增强，与注射前相比有显著增强（图2c）。定量分析显示，H2-MBs注射后信号强度迅速增加，注射后2分钟达到最大水平（123.39±6.34 dB），然后在5分钟后下降至87.86±8.12 dB（图2d）。此外，我们发现H2-MBs可以进入大鼠心肌组织（图2e）。注射H2-MBs后，心肌组织的超声信号强度比注射前增加了2.83倍（P<0.01）（图2f）。高能量破坏脉冲能够破坏H2-MBs，并导致超声信号强度显著降低，证实了心肌组织中存在H2-MBs（图S5）。

图2.H2-MBs的超声信号检测。（a）H2-MBs分散在各种浓度（5×105、5×106、5×107、5×108和5×109/mL）的PBS中的超声图像。使用Vevo 2100超声成像系统进行成像。（b）PBS中H2-MBs的超声信号强度的定量分析。（c）大鼠心脏LV中H2-MBs在静脉尾部注射H2-MBs前后的超声图像。使用Vevo 2100超声成像系统进行成像（n=3）。上排，注射H2-MBs前；下排，注射H2-MBs后；左侧面，B模式图像；右侧面，对比模式图像；LV，左心室（点线循环）。（d）H2-MBs注射进入大鼠后300秒的时间-强度曲线。箭头表示MB注射的时间。（e）大鼠心肌组织中H2-MB输送的超声图像。使用Philips IE33超声机进行成像。左侧，注射H2-MBs前；右侧，注射H2-MBs后；LV，左心室（红色循环）；IVS，心室间隔（蓝色循环）；RV，右心室（绿色循环）。箭头表示静脉注射H2-MBs后H2-MB输送到大鼠心肌组织中的情况。（f）H2-MBs的超声信号强度的定量分析（n=3）。**P<0.01。数据表示平均值±s.d.


3.3 H2-MBs限制心肌梗死面积。


然后，我们调查了不同剂量的H2-MBs对心肌缺血再灌注损伤后梗死面积的影响。大鼠经历30分钟的缺血和24小时的再灌注。左冠状动脉（LCA）闭塞后，通过心电图（ECG）S-T段抬高确认缺血（图S6），然后在再灌注前将H2-MBs或载体以低剂量（4×109个泡沫）或高剂量（2×1010个泡沫）浓度注入尾静脉。图3a显示了载体或H2-MB（高剂量）处理的大鼠的代表性横截面。评估梗死面积显示，高剂量H2-MBs显示出比低剂量H2-MBs更显著的细胞保护作用（P<0.01）（图3b）。接受高剂量H2-MBs的大鼠显示出12.81±3.21％的梗死面积，而与接受载体处理的大鼠（INF/LV：42.67±2.60％）相比，梗死面积减少了69.97％。相比之下，接受低剂量H2-MBs的大鼠显示出较少的细胞保护作用，梗死面积为26.21±3.10％，仅减少了38.57％。我们还检查了高剂量H2-MBs对经历30分钟缺血和3小时再灌注的大鼠的保护作用，梗死面积评估显示梗死面积减少了28.06％（P<0.05）（图3c）。

图3.H2-MBs预防心肌梗死。（a）给予对照微泡（左）或H2-MBs（右，高剂量）处理的大鼠经TTC染色的心肌连续切片的代表性图像。被染色阳性（红色）的组织代表活力心肌。未染色阳性（白色）的心肌代表梗死组织。（b）对于接受假手术处理的、接受车辆处理的或接受H2-MB处理的大鼠（低剂量，每只大鼠4×109气泡；高剂量，每只大鼠2×1010气泡）在LCA缺血30分钟和再灌注24小时后的心肌梗死面积的定量测定。接受H2-MB处理的大鼠显示出INF/LV显著减少（n=7）。*P<0.05，**P<0.01。数据表示平均值±s.d。（c）对于接受假手术处理的、接受对照MB处理的或接受H2-MB处理的大鼠在LCA缺血30分钟和再灌注3小时后的心肌梗死面积的定量测定；每只H2-MB处理的大鼠使用2×1010个H2-MBs。发现了类似的保护作用（n=5）。**P<0.01。数据表示平均值±s.d.


3.4 H2-MBs保护LV结构和功能。


为了确定H2-MBs对病理性LV重塑的影响，使用超声心动图监测了LV形态和功能，在经历30分钟的LCA缺血和24小时的再灌注后。与假手术处理的大鼠相比，载体处理的大鼠显示出心肌梗死后不良的病理性重塑。值得注意的是，在再灌注前注射H2-MBs可以减轻心肌梗死后的病理性重塑（图4a）。此外，接受H2-MBs处理的大鼠的左室舒张末期直径（LVEDD）和左室收缩末期直径（LVESD）与接受假手术处理的大鼠相比没有显著增加。相反，在心肌缺血再灌注后，接受载体处理的大鼠显示出显著增加的LVESD和LVEDD值（图4b）。此外，接受载体处理的大鼠在心肌缺血后显示出21.68％和15.81％的射血分数和短轴分数减少，而接受H2-MBs的大鼠显示出8.44％和7.21％的射血分数和短轴分数减少，分别较少（图4c）。

图4.H2-MBs减少不良的LV重塑。（a）接受假手术处理（假手术）、缺血再灌注对照微泡处理或缺血再灌注H2-MBs处理的大鼠的代表性M模式超声心动图像。对每组的M模式超声图像的测量是在缺血再灌注后48小时进行的。使用装备有MS-250扫描头探头的Vevo 2100系统进行成像，扫描速度为1000 Hz，频率为21 MHz。刻度条（垂直），4 mm。（b）基于超声心动图像，确定了LV尺寸，包括左室舒张末期直径（LVEDD）和左室收缩末期直径（LVESD）（n=5）。**P<0.01。数据表示平均值±s.d。（c）与对照组相比，H2-MB处理的大鼠的心脏收缩功能（FS％）和射血分数（EF％）显着改善（n=5）。**P<0.01。数据表示平均值±s.d。