摘要：缺血再灌注诱导的心肌细胞死亡是全球发病率和死亡率的主要原因。氢气（H2）作为一种抗氧化剂，已经显示出在预防和治疗缺血再灌注引起的致命损伤方面具有巨大潜力。然而，由于H2在水中溶解度较低，在血液和受损组织中的生物利用度较差。在这里，我们开发了一种超声可视的H2传递系统，通过将H2装载在微泡内（H2-MBs）来防止心肌缺血再灌注损伤。使用该系统，可以在常温和常压条件下大大提高单位体积中的H2浓度。H2-MBs可以在超声成像系统中进行可视跟踪，并能有效释放其治疗气体。在缺血再灌注开始时在活体系统中输注H2-MBs会导致明显减小的梗死区大小和病理重塑。进一步分析表明，这种方法显著抑制了心肌细胞凋亡，并减少了心肌缺血再灌注大鼠中的心肌炎症和氧化损伤。这些结果表明，H2-MBs是一种有前途的H2基治疗应用的可视传递系统。


1引言


心肌缺血再灌注损伤已被广泛接受为组织破坏和可能的心力衰竭刺激。当冠状动脉的一个或多个分支狭窄或闭塞时，心脏将失去氧气血液供应，随后的灌注和再氧化通常会导致组织损伤加剧。病理上，缺血再灌注损伤的一个潜在机制是受损心肌组织中活性氧自由基（ROS）的过度产生，特别是在再灌注的最初几分钟内。ROS的产生触发线粒体通透性过渡孔的开放，并导致一系列病理过程，包括各种细胞死亡程序、微血管功能障碍和炎症级联。


迄今为止，已经尝试使用一氧化氮、一氧化碳和硫酸氢盐等治疗气体来减轻心肌缺血再灌注损伤。大多数这些技术在实验室中表现出了前景，但在临床应用中的结果则不那么令人鼓舞。一个关键问题源于这些气体的固有毒性。最近，氢气（H2），作为最知名的分子之一，被提出对缺血再灌注损伤引起的器官功能障碍具有潜在的预防和治疗作用。与其他治疗抗氧化剂相比，H2的有效性已经在其他模型中广泛证明。与其他治疗抗氧化剂相比，H2具有许多独特的优点，包括：（i）其选择性减少最细胞毒性的ROS羟自由基，并在不干扰代谢氧化还原反应或破坏其他ROS参与细胞信号传导和其他生理作用的情况下有效保护细胞；（ii）能够穿透生物膜并扩散到细胞质、线粒体和细胞核中（其快速的气态扩散可能使其在减少细胞毒性自由基方面非常有效）；（iii）更重要的是，H2是一种对人类没有明显副作用的安全气体。


传统上，以下三种策略用于提供H2治疗应用：（i）直接吸入H2气体，（ii）饮用溶解在水中的氢气，或（iii）静脉/腹腔注射氢气饱和盐水。然而，所有传递策略的效果都取决于H2在水、盐水或血液中的溶解度。不幸的是，H2在水溶剂中溶解度较低，导致其在血液和受损组织中的生物利用度较差。此外，H2的易燃性在制备含H2配方时造成了巨大的困难和安全隐患。此外，目前尚无可用于生物医学应用的图像引导的H2传递系统。这些限制激发了寻找新的、安全的H2传递系统以有效治疗的动力。


微泡（MBs）是一种充满气体的小型微球体。长期以来，微泡因其在超声诊断中作为造影剂的临床应用而备受关注。除此之外，微泡还是重要的药物递送载体，能够在血液循环中稳定携带药物并具有多种治疗应用。药物可装载在微泡外壳上、嵌入外壳基质中或填充到内部空腔。近期研究报道了微泡作为封装治疗性气体载体的应用。本文通过大鼠模型实验，我们首次展示了载氢微泡（H2-MBs）作为抗氧化剂预防心肌缺血-再灌注损伤的潜力。


2材料和方法


2.1 H2-MBs的制备


以氯仿为溶剂，将购自Avanti Polar Lipid公司的1,2-二硬脂酰-sn-甘油磷酰胆碱（DSPC）和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基（聚乙二醇）-2000]（季铵盐，DSPE-PEG2000）按摩尔比90：10混合。将溶剂用稳定的氮气流蒸发到玻璃管上形成薄膜。然后将磷脂膜置于真空下约2小时，完全去除溶剂。然后，将干燥的磷脂膜在60℃下与含有甘油、1,2-丙二醇和0.1M三聚氰胺缓冲液的5mL缓冲液中水合，体积比为10：10：80，然后超声处理直至脂质膜完全分散。随后，将超声处理的磷脂悬浊液转移到密封的4mL玻璃瓶中（每瓶约1mL），并使用自行设计的装置将瓶中气体用八氟丙烷（C3F8）置换。将含有磷脂悬浊液和C3F8的瓶子用振荡器（MONITEX胶囊搅拌器，转速4500 rpm）机械振动45 s，得到对照MBs（载体）。为制备H2-MBs，通过1mL注射器向倒置的瓶中注入一定量的H2，然后通过另一个针头挤出较重的C3F8气体。然后，像上面提到的那样，对这些瓶子进行机械振动，以获得H2-MBs。


2.2 H2释放曲线的测量


根据先前的研究，使用针式氢气电极（Unisense）在磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）和血液中测量H2释放曲线。简要地说，向5mL PBS中加入0.2 mL H2-MBs或对照MBs（载体）。然后，通过将针式氢气电极浸入MB悬浮液中并实时记录数据来确定H2释放曲线。对于体内H2释放曲线，将针式氢气电极插入五只健康大鼠的左心室（动脉血），并通过静脉注射向大鼠注入2×1010 H2-MBs或对照MBs。然后连续记录血液中H2的浓度。


2.3超声成像


使用专用于小动物的高分辨率超声成像系统（Vevo 2100；VisualSonics，加拿大多伦多）或使用IE33超声机（Philips Medical Systems，MA）对H2-MBs进行超声成像。对于体外线性B模式超声成像实验，向透明袋中添加各种浓度（5×105，5×106，5×107，5×108或5×109/mL PBS）的H2-MBs；PBS用作对照。然后将袋子浸入水浴中，使用Vevo 2100成像系统进行超声成像，参数如下：探头MS-400；增益25 dB；焦深4−6 mm；发射功率30%；机械指数0.2；动态范围60 dB，帧率25 Hz；中心频率40 MHz。对于体内增强超声成像实验，将三只健康大鼠麻醉后，以1.5%异氟醚吸入，固定在仰卧位，然后用Vevo 2100成像系统对大鼠的左心室腔内的H2-MBs进行成像，参数如下：探头MS-250；增益20 dB；焦深21−23 mm；发射功率10%；机械指数0.2；动态范围40 dB，帧率17 Hz；中心频率18 MHz。为了检测已输送到心肌组织中的H2-MBs，使用Philips IE33超声机对心脏进行成像，参数如下：探头S5-1；增益44 dB；焦深1−3 cm；动态范围50 dB；帧率40 Hz；中心频率3 MHz。信号强度由QLAB软件定量。