3.4.变体MsdoY165F


氨基酸序列中位置165的酪氨酸被替换为苯丙氨酸。thereby，酪氨酸的羟基从预测的蛋白质活性位点中移除，但结合口袋的构架不应受影响。对于MsdoY165F，测定得到与野生型相同的Km值0.06 mM。催化效率降至20.37 mM⁻¹s⁻¹；而比活性测定为10.22μmol min⁻¹mg⁻¹，相当于野生型活性的约70%。


为便于比较获得的动力学数据，结果总结于表2。野生型酶及其活性变体的比活性在MsdoQ64A和MsdoY165F情况下非常相似。MsdoR66A显示仅非常低的活性，且由于每次测量需要大量蛋白质，未确定动力学数据。对于变体MsdoH93L、MsdoH95L、MsdoH163L和MsdoC100S，无法记录动力学数据，因为酶未显示任何活性。


4.讨论


在本研究中，生成并表征了最近鉴定和表征的V.paradoxus B4巯基琥珀酸双加氧酶的酶变体，以阐明对酶活性和底物配位重要的氨基酸残基。为此，通过定点诱变替换了Msdo的七个不同氨基酸残基。

Cdo及其同源物氨基酸序列中存在三个高度保守的组氨酸残基（图1），这些残基对辅因子配位和底物定位重要。Msdo中位置93、95和163的三个组氨酸残基各被亮氨酸残基替换。由于对应H93和H95的两个组氨酸残基被认为对半胱氨酸双加氧酶及其同源酶中的辅因子配位至关重要，生成的变体观察到的酶活性完全丧失证实了这些氨基酸在MsdoB4中的预期重要性。铁辅因子的重要性先前已详细研究。其中描述Msdo在没有Fe(II)作为辅因子时未显示任何活性，且其他金属离子（例如铜）无法恢复酶活性。此外，H163显然也对酶活性至关重要，thus表明其在底物在Msdo活性位点中定位的重要作用，如同人类Cdo活性位点中的H155。


Driggers及其同事表征了细菌Cdo及其同源物的两种不同结构类型，他们区分了“Arg型”和“Gln型”。“Arg型”在活性位点具有保守的精氨酸残基，是表现Cdo活性的酶的特征。另一方面，“Gln型”在活性位点携带保守的谷氨酰胺残基替代精氨酸，这是表现不同底物特异性的Cdo同源物（如Mdo）的特征。在MsdoB4中，两种残基都存在（Q64和R66），而Q64对应保守的Y58，R66对应保守的R60残基。为确定位置64的谷氨酰胺残基对酶活性的作用，将其替换为丙氨酸残基，产生酶变体MsdoQ64A。该变体表现出与野生型Msdo相似的比活性（见表2），但有趣的是显示显著增加的Km值，表明对底物的亲和力较低。因此，可能由于活性结合位点的变化，底物结合效率较低，导致在较高底物水平下达到最大反应速率，与野生型酶相比。尽管Q64A替换肯定对酶活性有影响，但该氨基酸残基似乎对催化非必需。

对于人类Cdo，当保守精氨酸（R60）被替换时，观察到活性降低至约30%并损失50%的配位亚铁。R66替换对Msdo活性的影响更强。仅当应用至少38μg酶时才能观察到活性。这一发现支持了该氨基酸可能参与底物配位的假设，可能作为氢网络的一部分，如同人类Cdo中观察到的那样。考虑到Q64A替换的较小影响，人们可能假设Msdo是“Arg型”Cdo同源物，尽管它对半胱氨酸无活性。


另一个推测参与底物配位的氨基酸残基是Msdo位置165的酪氨酸（对应真核Cdo的Y157）。此外，Y157是催化三联体的一部分，并与半胱氨酸（C93）交联，导致真核Cdo活性增强。然而，这种交联对活性非必需，且不存在于细菌Cdo同源物中。为研究该酪氨酸在Msdo酶活性中的作用，将其替换为苯丙氨酸，产生变体MsdoY165F。有趣的是，这种替换未导致显著受损的酶活性，但就Km值而言产生与野生型酶相同的结果，且比活性略有降低（见表2）。


Y165显然对酶活性不如其他Cdo同源物中相应残基重要，且可能它在Msdo中不是催化三联体的一部分，因为它的缺失可以被补偿，暗示该氨基酸残基对Msdo活性非关键，与Cdo活性相反。Msdo中唯一的半胱氨酸被突变为丝氨酸残基，产生变体MsdoC100S。该变体完全失活，表明该残基对酶活性重要。由于该半胱氨酸是Msdo中唯一的半胱氨酸，其缺失可能导致结构变化，从而影响酶活性。在人类Cdo中，C100被丝氨酸取代，但该残基在Msdo中可能对蛋白质折叠和resulting酶活性重要。


本研究中获得的Msdo野生型酶动力学数据（Km 0.06 mM,Vmax 14.68μmol min⁻¹mg⁻¹,kcat 5.61 s⁻¹）与先前研究（Km 0.4 mM,Vmax 20.0μmol min⁻¹mg⁻¹,kcat 7.7 s⁻¹）的差异很可能due to使用了不同的技术设备；即Unisense的OXMR氧传感器与Rank Brothers Ltd.的Dual Digital Model 20氧电极。由于后一种设备中无需移除电极即可添加酶启动反应，该方法应提供更准确的结果。


5.结论


本研究重点探究了Msdo蛋白中保守氨基酸残基的关键作用。研究证实，H93、H95、H163和C100这四个高度保守的残基至关重要——当这些残基被替换时，酶活性会完全丧失。而R66的替换导致酶活性显著下降，这印证了该位点可能参与辅因子配位的假说。Q64的替换虽然使Km值较野生型升高，但该氨基酸对Msdo活性并非必需。同样，Y165被苯丙氨酸取代后酶活性未受影响，但这种改变可通过其他机制得到补偿，这表明与Cdo活性不同，该氨基酸残基对Msdo活性并非关键。下一步将解析Msdo的晶体结构，这将有助于验证本研究关于Msdo活性位点结构特征及关键氨基酸在酶特异性和活性中作用的发现。