2.3.Msdo变体的表达和纯化


首先，在30°C和120 rpm旋转摇床中，在20 ml含抗生素的LB中培养含有相应质粒的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株约18小时。然后，用0.5 ml相应预培养物接种50 ml体积的也含有这些抗生素的LB主培养物，并在30°C和120 rpm下培养直至600 nm光密度达到0.6-0.8。通过添加终浓度为400μM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷并在25°C摇床上再培养20小时实现表达诱导。通过在4°C和9000 rpm下离心20分钟收获细胞。收获细胞后，获得的沉淀在-20°C储存直至进一步使用，或立即通过添加2 ml结合缓冲液和少量DNase进行处理。通过French Press在10,000 MPa下通过2-3次通道进行细胞破碎。对于蛋白质纯化，粗提物在4°C下以15,000g离心15分钟。获得的上清液进行镍-硝基三乙酸亲和层析，应用His SpinTrap柱按照制造商说明进行。洗涤缓冲液含有50 mM Tris/HCl pH 7.4、500 mM NaCl和40 mM咪唑；洗脱缓冲液由50 mM Tris/HCl pH 7.4、500 mM NaCl和500 mM咪唑组成。纯化的酶直接用于实验或在冰浴中储存直至使用。通过SDS-PAGE监测纯化。根据Bradford方法测定蛋白质浓度。


2.4.分析尺寸排阻色谱


为了确定不同酶变体与野生型Msdo相比的分子量，在Superdex 200 HP 16/600柱上进行分析尺寸排阻色谱。柱子用含有150 mM氯化钠的50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.4）平衡。使用凝胶过滤校准试剂盒低分子量按照制造商说明进行校准。将4 mg Ni-NTA纯化的野生型酶上样到柱上，以1 ml/min流速操作。监测280 nm吸光度以检测相应蛋白质。


2.5.应用Ellman试剂的酶测定


作为定性酶测定，最终体积为1 ml的样品含有50 mM Tris/HCl（pH 7.4）、25μM MS（DL-巯基琥珀酸）和4μg/ml相应酶，在25°C下在比色皿中孵育30分钟。然后，添加Ellman试剂5,5'-二硫双（2-硝基苯甲酸）至终浓度0.2 mM。DTNB与MS的游离巯基反应，释放黄色2-硝基-5-硫代苯甲酸，可在412 nm测量。


2.6.应用氧电极测量的定量酶测定


对于定量测定，使用连接PicoLog数据记录器和PicoLog记录器软件的氧电极Dual Digital Model 20。通过将所用缓冲液的氧浓度设为100%并使用含有0.1 M NaOH和0.1 M抗坏血酸的溶液确定缺氧条件来校准电极。此外，最大信号强度与相应温度下可溶氧最大值（25°C时为0.2409μmol/ml）相等。通过水浴、浸入式加热器带温度传感器和蠕动泵保持测量装置中温度恒定。酶活性测定测量在含有不同底物浓度（0.05 mM-150 mM）的缓冲液（50 mM Tris/HCl,pH 7.4）中进行，通过添加酶启动反应。作为对照，进行无酶和变性酶（95°C 10分钟）的测量。使用Microsoft Excel分析所得数据，同时使用Excel的Solver加载项计算非线性回归。


3.结果


为了进一步了解Msdo酶活性可能重要的氨基酸残基，对野生型酶以及本研究中生成的七种酶变体（MsdoQ64A、MsdoR66A、MsdoH93L、MsdoH95L、MsdoC100S、MsdoH163L和MsdoY165F）进行了酶活性和动力学测定。所有七种变体均成功表达为可溶性蛋白并纯化。然而，突变酶C100S的可溶性蛋白产量显著较低。关于野生型酶的大小，早期研究中观察到的二聚体结构得到确认。由于与先前研究使用的技术设备不同且为了更好的可比性，还记录了野生型Msdo的动力学数据（图3A）。在25°C下，计算得到表观Km值为0.06 mM，比酶活性（Vmax）为14.68μmol min⁻¹mg⁻¹，kcat为5.61 s⁻¹。

3.1.变体MsdoH93L、MsdoH95L、MsdoH163L和MsdoC100S


当将His93、His95和His163替换为亮氨酸时，对蛋白质三级结构的影响应尽可能小，观察到的酶动力学数据变化应归因于侧链功能基团的丢失而非蛋白质结构的丢失。出于相同原因，C100被丝氨酸取代，从而将半胱氨酸的巯基变为羟基。使用Ellman试剂的定性酶测定显示MsdoH93L、MsdoH95L、MsdoH163L和MsdoC100S无活性。此外，这些变体与亚铁离子预孵育未产生任何积极效果（数据未显示）。此外，当用氧电极测量活性时，无法确定这些变体的动力学数据。因此，未进行进一步表征。


3.2.MsdoQ64A的动力学数据


将Q64替换为丙氨酸是为了通过使用侧链无任何功能基团的氨基酸来禁用任何共价键形成，从而将Msdo归类为Arg型或Gln型Cdo同源物。对于变体MsdoQ64A，测定比酶活性（Vmax）为12.36μmol min⁻¹mg⁻¹，表观Km值为0.29 mM，kcat为4.79 s⁻¹（图3B）。相对于野生型酶，MsdoQ64A仍表现出约84%的比活性。


3.3.变体MsdoR66A


出于与MsdoQ64A相同的原因进行酶变体MsdoR66A。在定性预测试中，仅检测到MsdoR66A的酶活性非常低，这通过氧电极进一步检查（数据未显示）。至少需要应用38μg/ml的酶进行测量才能观察到酶活性。由于这些高量，未确定动力学数据。