Western印迹：


按照说明使用含1mMPMSF的RIPA缓冲液对回肠组织进行匀浆。组织匀浆在冰上裂解30分钟后，离心5分钟（4°C，12000g/min）收集上清液。在进行Western印迹前，使用BCA蛋白检测试剂盒对总蛋白浓度进行定量。将适当的蛋白质样品与SDSPAGE上样缓冲液混合，在95℃下变性10分钟。在8%或10%的SDS-PAGE凝胶中进行电泳，然后将蛋白质转移到PVDF膜上。在室温下用5%BSA将膜孵育2小时以阻断非特异性结合。然后用一抗（表1）在4°C下孵育过夜。室温下用HRP-山羊抗小鼠或兔IgG二抗（稀释度1:5000）孵育1小时，然后用ECL化学发光系统检测蛋白。用ImageJ软件分析膜的密度。


统计分析：


所有分析均采用GraphPad Prism7软件进行。统计分析采用单向方差分析。数据以平均值±平均值标准误差(SEM)表示。如果p值小于0.05，则认为统计差异显著。


结果：


1.HRS对大鼠回肠损伤的影响

图2光镜下观察回肠损伤。(A)H&E染色（200×，400×）：Sham组黑色箭头表示正常黏膜绒毛；I/R组红色箭头表示绒毛变性，固有膜暴露；HRS组蓝色箭头表示上皮下间隙扩展；4PBA组黄色箭头表示Gruenhagen间隙。(B）组织病理学评分。


四组回肠组织病理学变化见图2A。Sham组的回肠组织切片没有病理变化，粘膜绒毛正常。I/R组的绒毛变性，固有膜外露，毛细血管扩张。HRS组回肠绒毛轻度水肿，部分绒毛塌陷。4-PBA组的绒毛顶端出现上皮下间隙扩展。回肠组织的Chiu评分见图2B。I/R组回肠组织学损伤评分（5.67±0.33）明显高于假手术组（1.33±0.33）。HRS组（3.67±0.33）和4-PBA组（3.33±0.33）的得分明显低于I/R组。血清（IFABP）的变化也反映了类似的模式（表2）。与Sham组（1.98±0.07ng/ml）相比，I/R组的血清IFABP水平（2.78±0.26ng/ml）显著升高。服用HRS后，IFABP水平明显降低（2.10±0.11ng/ml）。然而，与I/R组相比，4-PBA并未降低IFABP水平的升高（2.38±0.05ng/ml）。


2.HRS对IIRI诱导的炎症细胞因子的影响

表2：各组血清IFABP、TNF-α和IL-1β水平。


与Sham组（57.30±6.19ng/L）相比，I/R组的血清TNF-α水平（113.40±15.76ng/L）明显更高。与I/R组相比，HRS组（62.02±10.60ng/L）和4-PBA组（59.17±7.24ng/L）的TNF-α水平明显降低。血清IL-1β水平的变化也反映了类似的模式（表2）。与Sham组（16.11±1.71ng/L）相比，I/R组的血清IL-1β水平（29.11±1.72ng/L）明显更高。HRS组（21.68±0.17ng/L）和4-PBA组（18.45±1.66ng/L）的IL-1β水平显著低于I/R组。


3.HRS对肠上皮紧密连接蛋白的影响

图3肠上皮紧密连接蛋白的位置和表达（A）IHC（200×）：肠上皮细胞间的棕色沉淀为闭塞蛋白的位置。(B)用IHC检测包被蛋白的表达。(C）IF（200×）：红色箭头所指的绿色荧光为ZO-1蛋白的位置。(D、E）Western印迹显示闭塞素蛋白的表达水平。(D，F）Western印迹显示ZO-1蛋白的表达水平。


I/R组的闭塞素蛋白表达水平（0.53±0.04）明显低于Sham组（1.00±0.00）。HRS组（0.81±0.03）和4-PBA组（0.72±0.05）的闭塞素蛋白表达水平明显高于I/R组。红色箭头所指的绿色荧光是Zonulaoccludens-1（ZO-1）蛋白的位置（图3C）。与Sham组、HRS组和4-PBA组相比，I/R组的荧光强度明显降低。Western印迹结果见图3D-F。HRS组闭塞蛋白的表达水平（0.79±0.04）高于I/R组（0.54±0.03）。但在4-PBA组（0.69±0.06）中没有统计学意义。HRS组（0.91±0.06）和4-PBA组（0.88±0.01）的ZO-1蛋白表达水平显著高于I/R组（0.51±0.08）。


4.HRS对ERS核心蛋白的影响

图4 ERS核心蛋白的位置和表达(A)IHC（200×）：肠上皮细胞胞浆中的棕色沉淀是GRP78蛋白的位置。(B）通过IHC检测GRP78蛋白的表达。(C）IF（100×）：红色箭头所指的绿色荧光为GRP78蛋白的位置。(D、E）Western印迹检测GRP78蛋白的表达水平。(D,F)Western印迹检测XBP1s蛋白的表达水平。


I/R组葡萄糖调节蛋白（GRP78）的表达水平（1.901±0.18）明显高于Sham组（1.00±0.00）。HRS组（1.19±0.16）和4-PBA组（1.26±0.15）的GRP78蛋白表达水平明显低于I/R组。红色箭头所指的绿色荧光是GRP78蛋白的位置（图4C）。与Sham组、HRS组和4-PBA组相比，I/R组的荧光强度明显增加。Western印迹结果见图4D-F。HRS组（1.41±0.04）和4-PBA组（1.49±0.10）的GRP78蛋白表达水平明显低于I/R组（1.96±0.12）。HRS组（1.44±0.16）和4-PBA组（1.37±0.16）的X-box结合蛋白-1s(XBP1s)蛋白表达水平明显低于I/R组（2.27±0.16）。


5.HRS对ERS诱导细胞凋亡的核心蛋白的影响

图5 RS诱导细胞凋亡的核心蛋白的位置和表达(A)IHC（200×）：肠上皮细胞胞浆和细胞核中的棕色沉淀是caspase-3蛋白的位置。(B）通过IHC检测Caspase-3蛋白的表达。(C）IF（100×）：红色箭头所指的绿色荧光为CHOP蛋白的位置。(D、E）CHOP蛋白的表达。(D，F）caspase-3蛋白的表达。


I/R组caspase-3蛋白的表达水平（3.33±0.23）明显高于Sham组（1.00±0.00）。HRS组（1.61±0.13）和4PBA组（1.62±0.12）的caspase-3蛋白表达水平明显低于I/R组。红色箭头所指的绿色荧光是C/EB同源蛋白（CHOP）蛋白的位置（图5C）。与Sham组、HRS组和4-PBA组相比，I/R组的荧光强度明显增加。Western印迹结果见图5D、E、F。Caspase-3蛋白在HRS组（1.50±0.19）和4-PBA组（1.49±0.19）的表达水平明显低于I/R组（2.40±0.26）。HRS组（1.43±0.15）和4-PBA组（1.48±0.12）的CHOP蛋白表达水平明显低于I/R组（2.40±0.20）。