摘要：


脓毒症诱发的肝功能障碍被认为是多器官功能障碍综合征（MODS）和死亡的独立风险因素。有丝分裂是自噬的一种选择性形式，在脓毒症诱发的器官损伤中发挥着重要作用。我们已经证明，氢气（H2）是一种选择性抗氧化剂，对脓毒症小鼠有保护作用。在此，我们假设氢气对脓毒症动物肝脏损伤的治疗作用可能是通过调节Fun14含域蛋白1（FUDNC1）诱导的有丝分裂途径实现的。雄性C57BL/6J小鼠接受假手术或盲肠结扎术（CLP），并在假手术或CLP手术后1小时开始吸入2%的H2气体治疗3小时。为了验证FUNDC1的作用，在假手术或CLP手术前24小时，向小鼠腹腔注射了具有FUNDC1抑制作用的细胞穿透肽P（1mg/kg）。为了评估脓毒性肝损伤的严重程度，我们评估了假手术或CLP手术后的7天存活率、肝组织病理学评分、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平、呼吸控制比（RCR）以及FUDNC1、P-18-FUDNC1、P62、LC3B-II、Tim23和caspase-1水平。结果表明，吸入2%H2气体可提高败血症后的7天存活率、ALT和AST水平、RCR、P62和LC3B-II表达，但会降低组织学评分以及FUDNC1、P-18-FUDNC1、Tim23和caspase-1水平。然而，CLP+肽P组和CLP+H2+肽P组之间没有明显差异。这些观察结果表明，吸入2%H2气体3小时可通过调节FUNDC1依赖性的有丝分裂，作为脓毒症诱导的肝损伤的有效治疗策略。


引言：


败血症是由入侵微生物诱发的一种公认的全身炎症反应综合征（SIRS）。败血症的发病率已从1.5%上升到8%，全球每年有超过1800万人罹患败血症。然而，目前还没有治疗败血症的有效方法。作为人类最大的腺体，肝脏在脓毒症的新陈代谢和免疫平衡中发挥着关键作用。在败血症期间，入侵的细菌及其产物首先被肝细胞捕获并清除。与此同时，肝脏免疫细胞释放促炎介质，可能导致急性肝损伤。有证据表明，急性肝功能不全和衰竭可能直接导致败血症患者病情恶化和死亡，而改善肝损伤或恢复肝功能可降低这些患者的发病率和死亡率。


分子氢（H2）是一种特殊的选择性抗氧化剂，可有效用于治疗70多种疾病。与维生素E等传统抗氧化剂相比，氢具有两个独特的特性。首先，它能轻易穿透细胞膜，迅速转移到细胞核和线粒体。其次，它能选择性地中和细胞毒性较强的羟基（OH-）和过氧亚硝酸（ONOO-）自由基，而不与毒性较弱的活性氧（ROS）发生反应。我们之前的研究表明，吸入H2气体或饮用富含氢气的生理盐水可有效防止败血症和败血症引起的器官损伤，包括肝、肺、脑和肾。我们还展示了吸入2%H2气体可显著缓解肝损伤，提高败血症小鼠的7天存活率。然而，其根本机制仍不清楚。


线粒体为有机生命提供约90%的能量，是细胞的重要组成部分。线粒体还具有多种其他生物功能，包括调节ROS生成、细胞氧化还原反应、信号转导网络和细胞凋亡。在败血症患者中，重要器官的线粒体功能障碍可能会降低细胞能量水平，导致多器官功能衰竭。临床研究表明，针对线粒体功能障碍的治疗，而不是直接抑制炎症级联反应，可能会改善脓毒症患者的预后。


作为自噬的一种选择性形式，线粒体吞噬是在细胞器水平控制线粒体质量的基本过程。线粒体网络的维持和细胞新陈代谢的重编程也离不开丝裂噬。含Fun14结构域的蛋白1（FUNDC1）是丝裂噬受体之一，定位于线粒体外膜，在线粒体应激和缺氧时参与清除受损的线粒体。FUNDC1可与LC3B-II相互作用，并通过一些关键位点的可逆磷酸化调控缺氧诱导的选择性有丝分裂。


在此，我们旨在揭示FUNDC1诱导的有丝分裂在败血症引起肝损伤的发病机制中的作用，以及在败血症小鼠盲肠结扎和穿刺（CLP）模型中吸入2%H2气体的保护机制。


材料与方法：


动物和实验方案：


动物实验方案须经天津医科大学总医院机构动物护理和使用委员会批准。成年雄性C57BL/6J小鼠（6周龄，体重20-25g）来自军事医学科学院实验动物中心。所有动物均在稳定的环境（温度22°C±1°C，湿度50%-60%，12:12h光暗循环）中获得充足的食物和水。小鼠随机分为五组：假组、CLP组、CLP+肽P组、CLP+H2组和CLP+H2+肽P组。为了验证FUNDC1的作用，在CLP或假手术前24小时给小鼠腹腔注射细胞穿透肽P，这是一种FUNDC1抑制剂。其他组小鼠注射相同体积的生理盐水。脓毒症模型由CLP产生。与CLP组小鼠相比，假手术组小鼠除CLP处理外，其余过程相同。CLP+H2组和CLP+H2+肽P组小鼠在假手术或CLP手术后1小时开始吸入H2气体（2%）3小时，而假手术组、CLP组和CLP+肽P组小鼠仅吸入空气（21%O2）。在假手术或CLP手术后1小时，分别在开始吸入H2气体后的0、10、20、30、45、60、120和180分钟，以及终止吸入H2气体后的5、15、30、45和60分钟测量各组小鼠动脉血和静脉血中的H2气体浓度。分析了假手术或中电刀手术后第1至7天各组的存活率。手术后6小时，我们处死小鼠并获取血液样本和肝组织。肝脏切片用于组织学检查。从手术后6小时的肝组织中分离线粒体，分析呼吸控制比（RCR）。血液样本中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定，肝组织中的FUNDC1、p-18-FUNDC1、P62、LC3B-II和caspase-1水平通过Western印迹法测定（图1）。

图1：实验设计。雄性C57BL/6J小鼠（6-8周大，体重20-25g）接受假手术或CLP手术。我们使用2%的氢气（H2）或新鲜空气处理小鼠，从假性或CLP手术后1小时开始，持续3小时。为了验证FUNDC1的关键作用，我们在CLP或假手术前24小时给小鼠腹腔注射细胞穿透肽P（一种FUNDC1抑制剂）；其他组则注射相同体积的生理盐水。在假手术或CLP手术后6小时收集各组小鼠的血清样本和肝组织。


CLP模型：


CLP模型的制作方法与我们之前的研究相同。首先，向小鼠腹腔注射溶于生理盐水的2%戊巴比妥钠作为麻醉。将小鼠放在特制的动物用无菌手术台上，在腹部做一个长约1厘米的中线切口，暴露盲肠。结扎盲肠远端四分之一处，用20号针头穿刺盲肠远端。通过穿刺点挤出部分排泄物。最后，将盲肠轻轻放回腹部，用无菌3-0号丝线缝合切口。手术后，向小鼠皮下注射1毫升生理盐水进行复苏。


H2气体处理：


H2气体处理程序按照之前的描述进行了一些修改。小鼠被放入一个密封的有机玻璃箱中，箱内有进气阀和出气阀。由TF-1气体流量计以4升/分钟的速度向箱内输送与新鲜空气混合的H2气体。小鼠呼出的二氧化碳由一袋巴里梅清除。用一个特殊的手持探测器监测H2气体浓度。我们使用2%的H2气体对小鼠进行治疗，从术后1小时开始，持续3小时；而假小鼠或CLP组的小鼠则被放置在同一箱中，箱内有空气（21%O2），但没有2%的H2气体。


测量H2气体浓度：


按照之前的描述，使用针式氢气电极（UnisenseA/S，丹麦奥胡斯）检测动物动脉和静脉血样本中的H2气体浓度。在开始吸入H2气体后的0、10、20、30、45、60、120和180分钟以及结束吸入H2气体后的5、15、30、45和60分钟采集动脉和静脉血样本。


存活率测定：


观察假手术或CLP手术后第1-7天的小鼠存活率。试验重复两次。


组织学分析：


在术后6小时获得肝组织标本（5μm），并用苏木精-伊红染色以评估肝损伤程度。用光学显微镜观察肝损伤，评分标准如下：囊炎、门脉炎、斑点状坏死、气球变性和脂肪变性。


转氨酶分析：


手术后6小时从小鼠左心室采集血样，并使用自动生化分析仪检测血清AST和ALT水平。


肝线粒体的分离：


肝脏线粒体通过传统的差速离心法获得。简而言之，采集肝脏右叶并在冰冷的分离缓冲液中切碎，该缓冲液含有70mM蔗糖、220mM甘露醇、5mM HEPES、1mM苯甲磺酰氟（PMSF）和0.2%脱脂牛血清白蛋白（BSA），pH值为7.4。在分离培养基中用玻璃匀浆器将无血组织匀浆，匀浆在1500×g和4°C下离心10分钟。上清液在12,000×g和4°C下离心10分钟。排除上清液后，将线粒体颗粒重悬于含有70mM蔗糖、220mM甘露醇和5mM HEPES的培养基中。以BSA为标准，采用Coomassie亮蓝法测定线粒体蛋白水平。在线粒体呼吸测定过程中，将新获得的线粒体悬浮液置于冰上（0-4°C）培养，在4小时内进行测定。


线粒体呼吸分析：


使用OroborosOxygraph-2K仪器在25°C下检测线粒体呼吸。将肝脏线粒体加入反应介质中。将线粒体引入室中约5分钟后，加入琥珀酸（5mM）。在观察到稳态4呼吸阶段后，加入50mM ADP以达到状态3呼吸状态。总ADP的消耗将导致恢复到稳态4呼吸阶段。在两次实验之间，用清水和乙醇对实验箱进行两次清洗。根据状态3/状态4呼吸的比率计算RCR。


Western印迹分析：


手术后6h处死小鼠，收集不同组的肝组织，用放射免疫沉淀法（RIPA）缓冲液裂解提取蛋白质。使用双喹啉酸蛋白质测定试剂盒对蛋白质总量进行定量。等量用于检测FUNDC1、p-18-FUNDC1、P62、LC3B-II和caspase-1的表达。一抗包括抗FUNDC1、抗p-18-FUNDC1、抗P62、抗LC3B-II多克隆、抗caspase-1：使用抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶和特异性二抗。蛋白条带用化学发光加试剂处理，并用增强化学发光（ECL）试剂显色。使用GeneTools软件计算各条带的强度。FUNDC1、p-18-FUNDC1、P62、LC3B-II和caspase-1的相对水平与GAPDH水平进行归一化。


统计分析：


存活率以百分比（%）表示，其他数据以均数±标准差（SD）表示。采用对数秩检验分析不同组的7天存活率。我们使用非配对t检验或Mann-Whitney检验来分析两组（假组与中电组、中电组与中电+H2组、中电+肽P组与中电+H2+肽P组）之间的差异。我们还使用单因素方差分析（ANOVA）来分析所有组间的交互作用。P<0.05的值被认为具有统计学意义。


FUNDC1依赖性线粒体自噬及氢气电极验证：氢气缓解脓毒症肝损伤的机制——引言、材料与方法

FUNDC1依赖性线粒体自噬及氢气电极验证：氢气缓解脓毒症肝损伤的机制——结果

FUNDC1依赖性线粒体自噬及氢气电极验证：氢气缓解脓毒症肝损伤的机制——讨论、结论