结果：


1.小鼠动脉血和静脉血中的H2气体浓度

图2：小鼠吸入2%H2后动脉血和静脉血中H2浓度变化。


在假手术或CLP手术后1 h，分别于H2开始吸入后0、10、20、30、45、60、120、180 min和H2停止吸入后5、15、30、45、60 min，通过氢气电极测定小鼠(A)动脉血和(B)静脉血中的H2浓度。


术后1小时，小鼠动脉中H2气体浓度并测量静脉血样。如图2A和B所示，假+H2和CLP+H2组小鼠的H2浓度从动脉和静脉血样中H2吸入开始，从0到45分钟逐渐增加。H2浓度在吸入H2 45分钟时达到峰值，在开始吸入H2后的45至180分钟内，动脉血和静脉血样本中的H2浓度均维持在最高水平。吸入H2结束后，假+H2组和CLP+H2组小鼠动脉血和静脉血中的H2浓度迅速降至基线水平（图2A和B）。然而，CLP+H2组和假+H2组之间没有观察到明显的差异。


2.FUNDC1和p-18-FUNDC1的表达水平

图3：吸入H2对小鼠肝组织中FUNDC1和P-18-FUNDC1表达水平的影响。


假手术或CLP手术后6小时，取肝标本。western blotting检测FUNDC1和P-18-FUNDC1水平(A)定量分析(B)FUNDC1和(C)P-18-FUNDC1表达为蛋白密度相对于GAPDH密度的比值。


手术后6小时，用Western印迹法评估FUNDC1和p-18FUNDC1的蛋白水平（图3A）。盲肠结扎组小鼠的FUNDC1和p-18-FUNDC1水平低于假组（图3B-C）。然而，与中性粒细胞白蛋白组相比，2%H2处理可降低中性粒细胞白蛋白+H2组小鼠的FUNDC1和p-18-FUNDC1表达水平（图3B-C）。


3.存活率

图4：吸入H2对小鼠7天存活率的影响，观察不同治疗组小鼠7 d的存活率。


在为期7天的实验观察中，假组只有一只小鼠死亡。此外，与假组相比，盲肠结扎组小鼠的7天存活率明显下降。与CLP组相比，CLP+H2组在吸入2%H2后的7天存活率明显提高。然而，CLP+肽P组和CLP+H2+肽P组之间没有统计学差异（图4）。


4.肝损伤

图5：吸入H2对小鼠肝组织及血清肝损伤的影响。


假手术或CLP手术后6 h处死小鼠，取肝组织进行(A)HE染色(原放大×200)。通过观察肝形态结构(B)对肝损伤进行评分。采集小鼠血清样本检测ALT(C)和AST(D)水平。


我们使用HE染色法评估假手术或CLP手术后6小时肝组织的组织病理学变化（图5A）。正常小鼠的肝组织没有明显变化。在CLP组，大面积肝小叶出现了与肝损伤相关的形态学变化，包括斑点状坏死和囊膜炎。然而，与CLP组相比，CLP+H2组小鼠的损伤明显减轻（图5B）。此外，血清样本中的谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平也用于评估肝损伤状况。与假组小鼠相比，CLP组小鼠的谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平明显升高（图5C和D），而吸入2%H2组小鼠的谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平明显下降（图5C和D）。然而，CLP+肽P组与CLP+H2+肽P组之间的病理评分和ALT、AST表达无统计学差异（图5B-D）。因此，肽P可以抑制H2对败血症小鼠肝损伤的治疗作用。


5.线粒体呼吸

图6：吸入H2对小鼠肝组织线粒体呼吸的影响。


术后6 h分离肝脏线粒体。(A)通过Oroboros Oxygraph-2K仪器评估耗氧量，(B)呼吸控制率(RCR)计算为状态3与状态4的比值。


手术6小时后，分离肝脏线粒体并评估线粒体呼吸水平（图6A）。RCR级别CLP组小鼠的减少与CLP组相比假手术组（图6B），但2%H2处理改善了CLP+H2组小鼠的RCR水平（图6B）。CLP+肽P组和CLP+H2+肽P组的小鼠之间没有统计学差异（图6B）。


6.P62、LC3B-II、Tim23和caspase-1的蛋白质水平

图7：吸入H2对小鼠P62、LC3B-II、Tim23和caspase-1表达水平的影响。在假手术或CLP手术后6 h收集各组肝脏组织，(A)用western blotting检测有丝分裂相关蛋白的表达。(B)P62，(C)LC3B-II，(D)Tim23，(E)caspase-1的定量分析为测试蛋白相对于GAPDH的密度比。


自噬相关蛋白（P62、LC3B-II、Tim23和caspase-1）的蛋白水平通过Western印迹进行了分析（图7A）。与假组相比，CLP组的样本显示P62和LC3B-II水平升高，而CLP+H2组的样本显示这些蛋白的水平高于CLP组（图7B和C）。此外，CLP组样本的Tim23水平低于假组，而CLP+H2组样本的Tim23表达水平进一步降低（图7D）。Caspase-1是炎症反应的重要生物标志物。与假组相比，CLP组样本的Caspase-1水平明显升高，而2%H2处理则导致Caspase-1表达下降（图7D）。在CLP+肽P组和CLP+H2+肽P组之间没有观察到所有这些蛋白水平的明显差异（图7B-D）。


这些结果表明，脓毒症可提高FUNDC1诱导的有丝分裂水平，而这种效应在2%H2处理后可进一步增强。此外，FUNDC1抑制剂多肽P能有效阻断败血症诱导的有丝分裂，并逆转H2对败血症小鼠肝损伤的保护作用。



FUNDC1依赖性线粒体自噬及氢气电极验证：氢气缓解脓毒症肝损伤的机制——引言、材料与方法

FUNDC1依赖性线粒体自噬及氢气电极验证：氢气缓解脓毒症肝损伤的机制——结果

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