4讨论


与单个细胞相比，间充质干细胞球表现出更高的细胞存活率和营养因子分泌量，使其成为细胞疗法中一种很有前景的移植选择。然而，对于间充质干细胞球体是否含有缺氧核心，以及缺氧核心是否直接导致了间充质干细胞球体的这些增强特性，文献中还存在分歧。在这些研究中，我们确定间充质干细胞球体内的氧梯度与体外氧分压相差不到10%。随着间充质干细胞球体大小的增加，球体内的堆积密度降低，从而促进了氧气和营养物质的运输。尽管如此，我们发现葡萄糖的消耗随着球体尺寸的增大而发生了明显变化。这些数据表明间充质干细胞球体功能随球体大小而变化，但间充质干细胞球体功能的增强并不是由于球体核心缺氧所致。


假定间充质干细胞球体内存在缺氧核心主要是基于有报告显示癌细胞形成的球体内存在缺氧和坏死核心，以及最近肝细胞球体内存在缺氧核心。我们无法将这些发现应用于间叶干细胞，因为癌细胞和肝细胞都存在于高氧的龛位中，而间叶干细胞通常存在于生理氧分压低得多的龛位中。因此，不同类型细胞能够诱导坏死的氧分压可能不同。此外，间充质干细胞球形体的应用与癌症球形体有很大不同，因为球形体的形成会促使间充质干细胞分泌更多的营养因子，而癌症球形体则被用作体外肿瘤模型。由于缺氧性肿瘤具有抗辐射的特性，癌症球形体被设计成以坏死为核心，周围为缺氧区，以有效研究治疗策略。虽然我们在用60000个或更少的间充质干细胞形成的球体内没有检测到缺氧核心，但其他报道称间充质干细胞球体内的缺氧诱导因子(HIF-1a)趋于稳定，这代表了改善细胞存活和生长因子分泌的潜在途径。不过，这种说法是基于对直径小于200μm的间充质干细胞球体进行免疫荧光染色，而且染色只发生在球体外围，更可能是聚集应力而非氧分压梯度的结果。其他研究人员通过对球体横截面进行组织学分析来研究缺氧核心的存在，结果表明直径达1000μm的球体内存在增殖细胞。据我们所知，这是第一项直接测量间充质干细胞球体内氧分压空间分布的研究，即使是由60000个间充质干细胞形成的最大球体，其中心也没有接近缺氧状态。事实上，我们在制作含有至少25万个间充质干细胞的球体时才发现缺氧核心的形成。缺氧并没有氧分压的严格定义，它取决于细胞类型和生理条件。我们将缺氧定义为允许细胞存活和发挥功能的临界氧分压。我们在实验和数值上只观察到氧分压的微小变化，不足以通过组织学分析引起细胞窘迫的迹象，这表明在这些球体内没有发生缺氧信号传导。然而，由于设备的限制，这些研究是在环境空气中进行的，在氧气和营养物质较少的体内，诱导梯度可能会变得更加显著。尽管如此，这并不会降低这些研究结果的影响，因为间充质干细胞球体在环境条件下分泌营养因子增加的情况此前已有报道。


随着每个球形体细胞数量的增加，堆积密度降低，形成了紧密堆积的较小球形体和松散堆积的较大球形体。这可能就是为什么氧分压在较大的球体内没有显著降低的原因，因为较大的细胞间空间允许氧气和营养物质向球体中心运输。对特定癌系球形体的研究未能证明球形体大小与堆积密度之间存在这种相关性。虽然间充质干细胞球体内的细胞活力和肌动蛋白介导的收缩力呈正相关，但这种适应性堆积密度以前从未报道过。然而，由于分化状态和动态培养条件的不同，间充质干细胞球体形态也存在差异，这两者都可能影响整个球体的氧扩散。氧扩散率的增加也反映在K/D值上，因为较小的紧密包裹球体(每个球体含有15000个细胞)的K/D值是60000个细胞球体的两倍多。有趣的是，虽然氧梯度并不严重，但增加每个球形体细胞的数量会显著增加Caspase的活性并降低代谢活性。这与我们之前的研究结果一致，我们发现较小的球体具有更强的代谢活性和增殖能力。其他研究报告称，改变每个球形体的细胞数对每个细胞的三磷酸腺苷(ATP)水平没有影响；不过，这些研究是在每个球形体有500到5000个细胞的情况下进行的，这些球形体可能还不够大，不足以引起代谢活性的变化。


许多研究都报道了间充质干细胞球体内Caspase活性增加的现象，并推测这种现象是由于聚集应力造成的。在这些研究中，我们观察到较大的球体中Caspase水平升高，但没有缺氧核心，而且它们表现出堆积密度降低，这可能是由于聚集应力降低所致。在这些球体内没有检测到凋亡的早期和中期标志物AnnexinV。因此，细胞凋亡似乎既不是氧分压的功能，也不是聚集应力的功能，这表明三维聚集体中有一个独立的中介，值得进一步研究。


我们观察到葡萄糖消耗量随着球形体大小的增加而减少，细胞内葡萄糖和6-磷酸葡萄糖也减少了，但我们通过乳酸-葡萄糖比值发现葡萄糖代谢没有变化。葡萄糖消耗减少但乳酸-葡萄糖比值保持不变，这表明葡萄糖摄取受损是球形体大小的一个功能。球粒直径是否会调节葡萄糖转运体的表达和/或活性，或许是通过AMP激酶(其活化受葡萄糖生物利用率的调节)，这是个引人入胜的可能性。之前对二维粘附间充质干细胞的研究结果显示，不同物种的代谢特征各不相同。同样，一个物种中来自不同供体的间充质干细胞表现出不同的乳酸-葡萄糖比率，这表明了代谢的异质性。相比之下，我们发现球形间充质干细胞的乳酸-葡萄糖比率与球形大小或供体无关。间充质干细胞球体处理葡萄糖和6-磷酸葡萄糖的代谢途径仍有待明确。乳酸-葡萄糖比率随着每个球形细胞数量的增加而降低，这表明葡萄糖通过三羧酸(TCA)循环被完全氧化成二氧化碳。另外，葡萄糖也可转入合成代谢途径(磷酸戊糖途径产生用于还原生物合成的NADPH或形成用于核苷酸合成的核糖-5-磷酸)。虽然目前还没有其他研究对间叶干细胞球体的生物能进行研究，但刘等人的研究发现，播种密度会影响细胞的新陈代谢。与高密度培养的细胞相比，低密度培养的间充质干细胞依赖有氧糖酵解产生ATP，糖酵解与TCA循环的耦合减少，磷酸戊糖途径的活性增强。这些结果是否能转化为球形细胞内的三维培养还需要进一步研究，但这些数据表明，不同大小的球形细胞在减少移植到低氧微环境中形成的活性氧方面可能具有不同的能力。


随着球形体体积增大，葡萄糖摄取量和细胞存活率降低，其中一个可能的机制是蛋白质含量减少导致可用的整合素结合位点减少。虽然确切的机制还有待阐明，但球体形成的简化模型涉及细胞-细胞接触、粘附蛋白积累、ECM沉积、整合素结合和球体压实。然而，由于间充质干细胞球体会调整其堆积密度，以便于氧气和营养物质的运输，这就牺牲了ECM的沉积和细胞粘附的整合素位点。细胞基质能增强细胞的存活和功能，而间叶干细胞球体的形成能促进层粘连蛋白、弹性蛋白、1型胶原和纤连蛋白等ECM蛋白的生成。此外，我们最近证实，间充质干细胞球体(每个球体含有15000个细胞)可沉积富含胶原蛋白的ECM，而间充质干细胞的整合素与ECM的相互作用可驱动细胞的命运。因此，球体形成增强间充质干细胞功能的能力至少部分是由细胞-ECM相互作用介导的，而这些细胞-ECM相互作用随着球体大小的增加而减少。这反过来又可能导致细胞新陈代谢下降和细胞凋亡增加。


总之，由多达6万个间充质干细胞组成的球体不会出现缺氧核心，这一发现增加了其临床转化的潜力。形成大型、可存活的组织构建体的能力是组织工程领域面临的一项重大挑战。由于间充质干细胞球体能适应其堆积密度，因此不会出现坏死，它们是新兴的生物打印领域前景广阔的构建模块。间充质干细胞与其他多种细胞类型形成共生关系，可应用于各种不同的组织。