3结果


3.1间充质干细胞球体内氧气分布的数值模拟


图1(d)测量的氧分压值与球面距离的函数关系。(e)利用测得的氧分压值，通过公式(2.5)从每个球面尺寸的平均数据生成数学模型，并与球面内各点的平均氧分压值一起绘制。(f)根据测得的氧分压值计算每个球面的K/D。(g)通过将数学模型映射到适当直径的球体横截面上，在三维空间中显示氧分压与半径的函数关系。刻度线代表250μm。


对不同大小的球体每隔10μm测量一次氧分压(图1d)。培养基中氧分压的实验测量值为267μM O2，不同大小的球体中氧分压保持不变。在分析之前，将球体从悬挂的液滴转移到显微载玻片上。15000细胞球体和30000细胞球体之间的氧分压梯度没有明显差异，而60000细胞球体的氧分压下降速度几乎是15000细胞球体和30000细胞球体的两倍。数据归一化为非尺寸单位r/R，根据这些实验数据，利用公式(2.5)为每个球面生成数学模型(图1e)。计算出每个球面的α、β和γ值，然后用来计算b和K/D。对于所有三种大小的球面，我们确定γ全等于0，表明b=0。在这些研究中，我们将缺氧定义为允许细胞存活和发挥作用的临界氧分压。如果细胞不再具有活力，那么它们就无法消耗氧气和营养物质，因此b值代表了缺氧核心的边界，在这个边界上，dC/dr=0。因此，由于这些间充质干细胞球体的b=0，这些研究结果表明这些球体内不存在缺氧核心。


虽然球体内明显存在梯度，而且随着球体尺寸的增大，梯度也会随之增大，但在每个含有60000个细胞的最大球体内，外层细胞与内核之间的氧分压下降不到10%。无论球体直径大小如何，氧分压值在中心点之前都没有接近dC/dr=0的点，这表明这些球体没有表现出氧气传质的限制。然后利用数学模型中的a和b系数计算每个球体的K/D。与其他两种尺寸的球体相比，最小的球体(每个球体有15000个细胞)的K/D值有所增加，这表明如果假定不同直径的球体内氧气消耗的反应速率不变，则扩散系数较小(图1f)。利用方程(2.4)对各点的K/D进行数值求解，验证了这一假设(数据未显示)。为使三维氧梯度可视化，将数值数据映射到球体中平面的横截面上，改变球体直径，使其与每种尺寸的球体平均直径一致(图1g)。


3.2堆积密度随球面尺寸增大而降低

图2球粒堆积密度随着球粒尺寸的增大而减小。(a)计算了假设最大堆积密度的预测球面半径，并与测量的球面半径一起报告。(b)随着球面尺寸的增大，堆积密度明显降低。(c)DNA含量随每个球形体细胞数的增加而线性增加。(d)归一化蛋白质含量随着球形体大小的增加而减少。(e)H&E染色显示，15000细胞球体(i)比较大的30000细胞球体(ii)和60000细胞球体(iii)更紧凑。标尺条代表250μm。


我们注意到，测得的半径与每个球形体的细胞数并不呈立方关系。为了直观地说明这一点，我们使用公式(2.6)计算了假设最大堆积密度的预测球形半径，并将其与测量半径绘制成图(图2a)。较小球体(每个球体15000个细胞)的测量半径与预测半径相关性良好，但30000个和60000个细胞球体的测量半径分别比相应的预测半径大16%和25%。从这些数据可以看出，间充质干细胞球体的堆积密度一定会随着球体大小的增加而降低，从而使氧气和营养物质更容易渗透到球体中心。因此，我们使用公式(2.7)计算了堆积密度，并证实随着每个球形细胞数量的增加，细胞在球体内的堆积密度明显降低(图2b)。为了验证球体直径的差异是由于堆积密度而非细胞增殖造成的，我们对DNA含量进行了量化，作为每个球体内细胞数量的指标。DNA含量与每个球体内的细胞数量相关(R2=0.964)，证实每个液滴中的所有间充质干细胞都融入了球体内，在球体形成过程中细胞数量没有增加(图2c)。每个细胞的蛋白质含量随着堆积密度的降低而减少(图2d)，这表明在较大的球体内ECM含量相对减少。使用血红素和伊红(H&E)可进一步观察细胞的堆积密度和ECM含量，随着球体尺寸的增大，整个球体结构中的许多空腔变得更加明显。H&E染色还显示，在所有三种尺寸的球形体中，外层细胞看起来比内部细胞更密集，更细长，而且随着直径的增加，球形体的球形度普遍降低(图2e)。


3.3细胞活力和新陈代谢活性随着球形体大小的增加而降低

图3细胞存活和葡萄糖消耗受球形大小的影响。(a)间充质干细胞球体内Caspase 3/7酶活性，(b)葡萄糖总消耗量，(c)L-乳酸总产生量。


与较小的15000个和30000个细胞的球形体相比，最大的球形体(每个球形体有60000个细胞)显示出更高的Caspase活性，表明细胞凋亡(图3a)。通过测量葡萄糖消耗量和乳酸盐产生量，研究了球形细胞的有氧状态。总葡萄糖消耗量随着球体大小的增加而明显减少，15000细胞球体的葡萄糖消耗量比较大的60000细胞球体高出约四倍(图3b)。细胞内葡萄糖和6-磷酸葡萄糖水平的测量结果表明，较大的球体消耗的葡萄糖比较小的球体少。细胞内葡萄糖测量的是瞬时水平，而不是两天内的葡萄糖总消耗量，因此与葡萄糖总消耗量相比有数量级的减少。L型乳酸盐的总产生量与葡萄糖消耗量的趋势相同(图3c)。由于α-MEM中不存在L-乳酸，所有L-乳酸都是细胞代谢的结果。无论球形体大小如何，所有组从葡萄糖中产生的乳酸产量相似。


3.4细胞存活率和缺氧的组织学检测

图4细胞存活率的组织学分析表明，不同直径的球体之间没有明显差异。(a)活细胞(绿色)/死细胞(红色)染色显示，15000个、30000个和60000个细胞球体内的间充质干细胞存活率相同。一个60000细胞球体在甲醇中孵育，作为碘化丙啶的阳性对照(最右边)。(b)Annexin V(红色)和DAPI(蓝色)染色进一步验证了没有细胞凋亡，因为15000、30000和60000细胞球体的球心和外围都没有阳性染色。500000个细胞球体作为附件素V的阳性对照。标尺条代表500μm；图像使用20×物镜拍摄。(c)细胞凋亡指数的量化，以核心相对于外围的附件素V阳性染色面积计算。


使用活/死染料观察球体内的细胞活力，结果显示不同大小的球体之间没有明显差异。将较大球体内没有死细胞的情况与阳性对照进行比较后进一步得到了验证，阳性对照是将每个球体内含有60000个细胞的球体放入70%甲醇中培养，以便在使用活体/死体染料培养前杀死细胞(图4a)。从这些图像中可以看出，每个球体内的细胞都是活的。甲醇溶液导致阳性对照组的球形细胞收缩，形成长圆形。附件素V染色进一步证实，15000、30000和60000个细胞的球形核心内没有凋亡细胞(图4b、c)。这些结果与我们量化Caspase3/7蛋白酶活性的数据略有不同，后者表明细胞正在积极凋亡。Caspase活性的灵敏度很高，而且是以相对发光的形式测量的，因此它更有价值用于比较样本内的情况，而不是断定是否存在细胞凋亡，因为所有细胞群都有一个凋亡活性基线。

图5缺氧组织学分析表明，不同直径的球体之间没有明显差异。Pimonidazole(绿色)和DAPI(蓝色)染色进一步验证了15000、30000和60000细胞球体内没有缺氧核心。一个60000细胞球体在1%氧气中培养5天，作为皮尼达唑染色的阳性对照(右图)。刻度线代表500μm；图像使用20×物镜拍摄。


免疫组化染色进一步验证了我们的氧分压测量结果，并验证了缺氧核心的存在，因为任何球体内都没有皮尼达唑染色(图5)。Pimonidazole对低于14μM O2的区域进行荧光标记，常用于癌细胞球和肝细胞球，以划分缺氧核心的边界。因此，没有荧光信号表明这些球体内不存在缺氧核心。阳性对照组(每个球形体有60,000个细胞，收集前在1%氧气中培养5天)产生的球形体更松散、更小，这可能是由于培养基没有更新，细胞死亡程度高所致。


为了确定直径更大的球形体是否会在其核心部位出现明显的细胞凋亡和缺氧，我们分别形成了100000、250000和500000个细胞的球形体，并对其进行了附件素V和波尼哒唑染色。与本文报告的15000、30000和60000个细胞球体的结果不同，从每个球体250000个细胞的大小开始，就观察到了统计意义上显著的缺氧核心(补充材料，图S2)，这与核心中显著的附件素V信号相关。这些结果表明，间充质干细胞球体内确实存在缺氧核心，并与细胞凋亡增加有关，但只有在比本文研究的细胞体积大得多的情况下才会出现。