与离体间充质干细胞相比，间充质干细胞(MSCs)形成的球状体显示出更高的细胞存活率和营养因子分泌量，使其在细胞疗法方面具有治疗优势。目前，人们对其作用机制尚未达成共识。许多人假设，球体的形成是通过在直径足够大的球体内产生一个缺氧核心来增强细胞功能的。本研究的目的是通过测量直径不断增大的间充质干细胞球体内的氧分压，并将氧分压值与细胞功能相关联，从而通过实验确定间充质干细胞球体内是否会产生缺氧核心。每个间充质干细胞球体由15000、30000或60000个细胞组成，半径分别为176±8μm、251±12μm和353±18μm。氧分压值和数学模型显示，在最大的球体内，氧分压梯度与外径的变化不到10%。尽管氧分压的径向变化不大，但随着细胞数量和球体大小的增加，球体的细胞代谢显著下降。这可能是由于随着球体直径的增加，基质沉积和堆积密度适应性降低，从而使球体避免形成缺氧核心。总之，这些数据提供了间充质干细胞球体功能增强并非由氧气介导的证据。


1引言


间充质干细胞(MSCs)是目前广泛研究的再生疗法。然而，要将间充质干细胞疗法转化为临床实践，面临的一大挑战是确保间充质干细胞移植到缺损部位后的存活率和功能。先前的研究报告指出，缺血情况下细胞的高死亡率和低接合率降低了干细胞疗法的疗效，因为只有不到1%的间充质干细胞在移植到缺血缺损部位4天后存活。出现这些并发症的可能原因包括移植到缺氧和炎症环境中，以及从培养皿中收获扩增细胞时常用的蛋白水解酶处理导致培养过程中产生的细胞外基质(ECM)丢失。


我们和其他人已经证明，间充质干细胞形成三维球体后，整体功能增强，存活率提高。与同等数量的离体间充质干细胞相比，15000个细胞的间充质干细胞球体表现出相似的Caspase3/7蛋白酶活性，但分泌的血管内皮生长因子却高达100倍。用更多间叶干细胞形成的较大球体，其Caspase活性增加，代谢活性和增殖减少。由于营养物质运输的扩散长度受到限制，因此必须仔细考虑球体的大小，这一特点可能会使半径大于200μm的球体核心细胞容易缺氧和死亡。有人推测，球体内缺氧核心的存在可能会对细胞进行预编程，以促进细胞存活并增强其营养因子的分泌。因此，使用半径接近营养运输限制的球体可能会带来额外的优势，但如果半径超过营养运输限制则不会。然而，对于这种缺氧核心是否存在或是否是增强间充质干细胞球体功能的必要条件，文献中还存在分歧。


以前使用癌细胞和肝细胞进行的研究使用了氧微电极来测量它们的稳态氧值，而其他研究则生成了预测性数学模型，但无法直接测量氧分压值来验证模型。虽然已有大量建模研究致力于研究球体内的运输现象，但之前的研究是针对以不同速度消耗氧气和营养物质的非多介质细胞群体进行的。此外，间充质干细胞形成球状体的意义与癌细胞和肝细胞大不相同，因为间充质干细胞在体内不会自然形成球状体，而是作为一种工具，使细胞能够最大限度地分泌营养因子。最后，不同类型细胞的堆积密度和孔隙率不同，导致扩散速度也不同。


本研究的目的是评估间充质干细胞球体内的氧分压曲线，以确定是否存在缺氧核心，进而将细胞存活与这些聚集体中的氧供应相关联。我们使用氧微电极测量直径不断增大的球体内氧分压与半径的函数关系。数据被用于使用数学模型对球体内的氧梯度进行数值描述。我们测量了细胞活力和新陈代谢与球体大小的函数关系。最后，我们测量了球体直径和堆积密度，以研究细胞在较大球体内存活的潜在途径。这些研究结果加深了我们对球体大小、营养物质运输和细胞功能之间相互作用的理解。


2材料与方法


2.1细胞培养


使用来自两名供体的人骨髓间充质干细胞，无需进行其他表征。间充质干细胞在标准培养条件(37℃、21%O2、5%CO2)下，在添加了10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的最小必需培养基-α修饰(α-MEM)中扩增，直到第4-5代。


2.2球体的形成和表征


使用悬滴技术在48小时内形成间充质干细胞球体，每25μm液滴含15000、30000或60000个细胞。之所以选择这个范围，是因为之前有报道称，形成的球体大小低于或高于氧气的扩散极限，营养因子分泌增加，同时也是为了研究文献中报道的类似大小的球体。之所以选择这种形成持续时间，是因为它能够持续形成紧密的球体。球体聚集48小时后，通过明视野显微镜对球体直径进行量化，并使用IMAGEJ进行分析。


2.3氧分压测量


图1(a)氧气微电极和间充质干细胞球体的实验装置。


在25℃的环境空气中，使用Unisense氧气微电极OX-10(Unisense，丹麦)测量球体内的氧分压，该电极的外端直径为10μm，检测限为0.3μM O2。用玻璃微量移液管在微弱的吸力下固定球形体，使用Eclipse TS100显微镜观察微电极的放置情况。使用焦平面将微电极置于球体中部，每隔10μm测量一次氧分压，直至球体中心。为了避免微电极与玻璃微量移液器接触，没有对球面的整个直径进行剖面测量(图1a)。


2.4数学建模


在对相应位置的氧分压进行采样后，这些数据被用于生成数学模型。由于球体内的间充质干细胞在向中心扩散的过程中会消耗氧气，因此我们将这些数据与之前描述的同时消耗氧气的扩散运输质量转移方程进行了拟合：

(2.1)


其中，C为氧气浓度；t为时间；D为二元扩散系数；ψ为反应项，假设如下：


(i)系统处于稳定状态。


(ii)氧的变化只发生在一个维度上，即径向坐标r，而不取决于极角(θ)或方位角(w)。


(iii)氧气消耗的反应速率是零阶反应；细胞消耗氧气的最大速率K在每个球体内都是恒定的。


该方程可以用球面拉普拉卡矩改写为


(2.2)


r是径向坐标。


微分方程可以写成


(2.3)


可行的解决方案是


(2.4)


其中，R是球面半径；C0是球面的氧气浓度；b是dC/dr=0时的半径，代表球面内缺氧核心的边界(图1b、c)。

图1(b)低氧核心存在/不存在的示意图；(c)理论示意图，说明缺氧核心的存在/不存在对氧分压曲线的影响。


这可以进一步简化为


(2.5)


为了求解K/D[=]mol/(L*cm2)和b[=]μm的值，将氧气浓度和球体内相应的径向位置输入方程(2.5)，并在MATLAB中进行数值积分。


2.5球体尺寸和堆积密度分析


为了估算球体半径，假定细胞组装成球体时遵循均匀硬球紧密堆积的行为。类似大小的硬球阵列可达到的最大体积分数为π/全等于0:74，球体内间充质干细胞的直径估计为15μm，因此每个间充质干细胞的体积为1767μm3。

预测球面半径


(2.6)


堆积密度是用已知细胞数除以集合体体积计算得出的，假定为球形。


(2.7)


2.6评估细胞功能


球形形成后，用被动裂解缓冲液裂解间充质干细胞，使用Caspase-Glo 3/7分析法对每个样本的100μl裂解液进行凋亡定量测定。荧光在微孔板阅读器上检测，并与DNA含量归一化，DNA含量是使用Quant-iTPicoGreen DNA检测试剂盒从相同裂解液中测定的。根据生产商的说明，使用双喹啉酸测定法测定蛋白质浓度，并与DNA含量标准化。葡萄糖和乳酸的浓度由培养基样本和裂解缓冲液测定，并根据生产商的说明使用比色测定试剂盒进行评估。葡萄糖消耗量的计算方法是，从生产商提供的5.5mM初始储备培养基中减去剩余的葡萄糖浓度。由于α-MEM中不存在乳酸盐，因此培养基中测得的所有乳酸盐都是作为细胞呼吸的产物计算的。6-磷酸葡萄糖(G6P)是根据生产商的说明，使用市售的酶测定法对裂解液进行评估，并与细胞数量进行归一化。


2.7组织学分析


间充质干细胞球体的细胞活力是通过活-死检测法评估的，该检测法基于钙黄绿素AM和碘化丙啶同时测定活细胞和死细胞。作为碘化丙啶的阳性对照，在用钙蓝蛋白AM/碘化丙啶溶液孵育30分钟之前，按照生产商的说明将每个球形体含有60000个细胞的球形体放入70%的甲醇中孵育。为了观察球体内细胞凋亡早期至中期阶段的凋亡区域，在由10mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、140mM氯化钠和2.5mM氯化钙组成的缓冲液中，将与异硫氰酸荧光素(FITC)共轭的附件素V以1:20的稀释度涂抹在切片上。在清洗和成像之前，样品在37℃温度下与附件素V一起孵育30分钟。通过胰蓝排除法确定的存活细胞作为附件素V染色的阴性对照，而在750nM石杉碱中孵育20小时的细胞以及500000个细胞球作为阳性对照。所有样本均使用40,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染色。将FITC信号(annexinV)面积与蓝色信号(细胞核)面积进行归一化处理，以确定每个球形体内部和外围区域的凋亡指数，从而显示球形体内部是否存在凋亡核心。


为了观察球体内的缺氧区域，在球体内加入盐酸咪唑(200mM)并在环境空气中培养2小时。作为阳性对照，收集前将每个球形体含有60000个细胞的球形体在1%的氧气中培养5天，在此过程中也在1%的氧气中与咪唑一起培养。用试剂盒中1:50稀释的小鼠单克隆抗匹莫尼哒唑IgG对细胞进行初级检测，并用DAPI对细胞进行反染。


使用EclipseTE2000U显微镜和Andor Zyla数码相机对球形体进行成像。收集球状物并用10%福尔马林固定，用磷酸盐缓冲生理盐水清洗，然后包埋在HistoGel中。用Tissue-TekOCT化合物包埋样本，在CM1850型低温恒温器上切割10μm的切片，然后装入显微镜载玻片进行分析。为观察细胞形态，按上述方法收集球体并进行冷冻切片，但收集前不进行染色。然后用H&E染色切片并成像。