药物积累和分布研究

图4、用(A)化合物1、(B)化合物2和(C)饱和铂处理缺氧HT1080球体内的铂分布。使用20毫米薄的冷冻切片进行ICP-MS测量。


药物吸收和渗透不良被认为是不同化合物在球状模型中活性降低的因素。为了阐明所研究的铂复合物的药物渗透性与不同细胞毒性之间的关系，我们利用LA-ICP-MS对1、2和饱和铂在缺氧HT1080球体内的铂分布情况进行了研究。所有化合物在缺氧HT1080小球中的穿透性相当，铂在坏死球核中有聚集热点(图4A-C)，这表明铂复合物对缺氧区域有很高的亲和力，并强调了对这些区域可能产生的靶向效应。此外，我们还清楚地表明，药物渗透性并不是铂(IV)复合物在HT1080球形模型中细胞毒性差异的原因。

表3、用1-4处理的缺氧球状模型中的铂积累与化合物的还原率和亲脂性有关。


此外，缺氧球形体的药物总积累数据显示，与其他铂化合物相比，3号化合物被所有三种细胞系吸收的效果更好(表3)。这一发现与细胞毒性数据(表1)相关，因为化合物3在球形细胞和单层培养中的IC50值最低。一般来说，铂的积累量与化合物的亲脂性完全相关，因为亲脂性的顺序与积累量增加的顺序相当，3(最亲脂性)>2>1(最不亲脂性)(表3)。然而，亲脂性和蓄积性都与缺氧球体内的活化作用不一致。虽然化合物1在缺氧的CH1/PA-1球形体内显示出7倍的活化作用，化合物2显示出2倍的活化作用，但化合物1的累积效果不如化合物2。尤其是积累量最高的化合物3在缺氧CH1/PA-1球形体内的活性与化合物1相当。


总体而言，在所有研究细胞系的缺氧球形体中进行的积累研究显示了以下积累顺序：3>2>4>1。在缺氧的HT1080(3>2/4>1)、HCT116(3>2>4/1)和CH1/PA-1(3/1>2/4)球形细胞中获得的IC50值一般与蓄积顺序一致，化合物3的细胞毒性最强。然而，与单层培养相比，缺氧球形体中的活化顺序与积累数据没有相关性。低氧球形培养物(HT1080(1>2/4>3)；HCT116(1>4>2>3)；CH1/PA-1(1>4>2/3))中的活化顺序更强调了积累量最高的化合物3在低氧条件下的活化程度最低，而积累量最低的化合物1在低氧条件下的活化程度最高。这些结果表明，缺氧条件下的活性并不高度依赖于药物的积累和亲脂性，而似乎依赖于所应用的铂(IV)化合物的还原速度。


动物研究

图5、(A)等摩尔剂量的1号、2号和沙铂在雄性SCID小鼠皮下人类HT1080细胞肿瘤的体内活性(n=4，在第4、7、11、14天(黑色箭头所示)进行治疗)。(B)第15天，所有治疗组的肿瘤重量与阴性对照组相比，与对照组有显著差异。在阴性对照组和沙铂组中，由于分别有一只动物在第13天和第14天出现肿瘤溃疡，因此只能确定3只动物的肿瘤重量。(C)所有治疗组的体重。(D)在第15天收集的小鼠组织、血球和肿瘤中，用ICP-MS测定1、2和沙铂的铂浓度(平均值)。


1、2和沙拉铂(作为参比化合物)在SCID小鼠的人异种移植中进行了进一步研究。由于两种化合物在缺氧球形模型中的IC50值均有所降低或相当，且在小鼠模型中具有良好的适用性，因此敏感性较低的HT1080细胞系被选为最适合进行异种移植实验的细胞系。在第4、7、11和14天以等摩尔剂量给药(化合物1为8.3毫克，化合物2为9.1毫克，沙铂为10毫克)。沙铂仅引起短暂的生长延迟，在第11和12天肿瘤负荷减少(图5A)。然而，随后肿瘤又重新生长，导致第15天时肿瘤负荷与对照组动物几乎没有差异。关于我们的新型铂(IV)药物，还原性较慢的复合物1没有显示出任何抗癌活性。相比之下，最易还原物质2从第11天起就能显著减少肿瘤生长(图5A)，并在第15天显著减少肿瘤负荷(图5B)。这也反映在体重上，因为HT1080细胞肿瘤的快速生长与体重的缓慢下降有关，而在肿瘤负荷减少的2处理动物中却观察不到这种情况(图5C)。


将体内活性的顺序(1<沙铂<2)与物质的理化性质进行比较，可以看出与亲脂性没有关系，而还原率的作用似乎是一致的，中间还原率对体内活性非常有利。此外，肿瘤组织中的铂含量并不是唯一的决定性因素，因为2的蓄积程度并不是最高的，而是介于1和沙铂之间(图5C)。所有化合物都会在肾脏中蓄积，这表明会从肾脏排出，但值得注意的是，亲脂性最低的化合物1在肝脏中的蓄积量最高。在血流中发现2的铂浓度增加，表明与1和沙铂相比，它在循环系统中的滞留率更高。


用LA-ICP-MS分析铂在肿瘤切片中的分布情况


与利用ICP-MS测量组织中的平均铂浓度相比，利用LA-ICP-MS进行生物成像在评估铂在组织学异质结构中的分布方面具有优势。用化合物1、2或沙铂等摩尔处理SCID小鼠的HT1080肿瘤后，制备了LA-ICP-MS测量方法，以确定铂在显微镜下的积累情况。铂金的分布与组织学(通过连续切片的H&E染色观察)以及共聚焦显微镜下通过比莫尼哒唑染色共同定位的缺氧区域相关。由于皮莫尼唑染色需要固定步骤，因此无法同时检测坏死区域。

总的来说，使用相应的铂化合物处理后，在消融的肿瘤切片中观察到铂的不均匀分布。铂富集区(用红色表示)很可能与小鼠的血管(微血管)(图6B和E)、疏松的软组织(仅有少量肿瘤细胞浸润)以及横纹肌(图6C-E)相对应。相比之下，由更密集的肿瘤细胞组成的恶性组织的铂含量通常较低。这些结果与之前对携带CT26结肠癌的小鼠肿瘤中的铂复合物进行的LA-ICP-MS研究结果一致。


具体而言，在使用化合物1(图6A)和萨克拉铂(图6F)治疗后的肿瘤切片中，观察到铂富集和缺氧区域的相关性。使用化合物2治疗后的消融肿瘤样本显示存在肿瘤结节(由底层组织学证实)。同样，肿瘤结节周围的疏松软组织区域的铂含量也有所增加(图6D)。不过，铂金也高度集中在肿瘤结节中，组织学显示该处存在中心坏死区。有趣的是，波尼哒唑在这里与中央坏死区周围的铂富集边缘共定位。这些结果与HT1080球形体的激光消融数据一致，核心中的铂含量增加，并揭示了铂物种在体外和体内渗透到这些区域的能力。


总结


缺氧诱导铂(IV)药物在实体瘤中的活化是一种有吸引力的靶向抗癌疗法策略。因此，研究人员对三种铂(IV)复合物、其对应的铂(II)复合物以及作为参考复合物的沙铂的理化性质与非缺氧和缺氧二维及三维肿瘤细胞培养模型中细胞生物学反应之间的关系进行了研究。随后，在SCID雄性小鼠模型中进行了体内实验，为研究结果提供了支持。


虽然亲脂性、药物积累与二维和三维细胞毒性之间存在很强的相关性，但药物积累的程度与缺氧球体和SCID小鼠模型在缺氧条件下的活化程度几乎没有关系。相反，活性似乎取决于这些复合物的还原率，尽管数据表明在三个球形模型中的一个模型中，铂(II)物种4甚至也有活化作用。还原速率最低的复合物1在所有测试的细胞系和环境中活性最低，而还原速率最快的化合物3的活性似乎在缺氧三维模型中受到过快生物转化的影响，尤其是在敏感性较低的细胞系中。另一方面，化合物2的亲脂性和还原速度居中，似乎具有最佳特性，可产生较高的功效。这种复合物对体内肿瘤生长的抑制作用明显优于1和沙铂。据我们所知，与相应的二维模型相比，我们首次在三维CH1/PA-1体外模型中显示了铂(IV)复合物的活化作用。这些发现表明，这些铂(IV)化合物比沙铂更具优势。