摘要


实体瘤中的缺氧仍然是传统癌症疗法面临的一个挑战。作为抗药性、转移发展和药物生物加工的来源，它影响着治疗效果和疾病预后。生物还原性铂(IV)原药可能比传统的金属疗法更具优势，因为在还原性环境(如缺氧环境)中进行生物转化是药物活化的必要条件。本研究分两步筛选了具有不同还原率和亲脂性的实验性铂(IV)原药，目的是找出最合适的化合物进行进一步研究。第一步，利用一组对铂(II)化合物具有不同敏感性的癌细胞系，在缺氧多细胞球和单层培养中比较所有化合物的细胞毒性。其次，在SCID小鼠模型的缺氧异种移植物中测试了两种所选化合物与沙铂的比较，此外，还对这些化合物在缺氧球体和异种移植物中进行了基于(LA)-ICP-MS的积累和分布研究。我们的研究结果表明，虽然细胞摄取和细胞毒性与亲脂性密切相关，但与非缺氧条件相比，铂(IV)原药在缺氧条件下的细胞毒性和抗肿瘤活性取决于它们的还原率。


引言


顺铂自20世纪70年代末被批准用于癌症治疗以来，一直被广泛使用，因此常被称为"癌症青霉素"。这种化疗药物的持续成功激发了用于抗癌治疗的铂(II)化合物的进一步发展，产生了数百种顺铂类似物。除顺铂外，奥沙利铂和卡铂是唯一广泛应用于临床的金属基抗癌药物，而其他药物，如皮铂，目前正在进行临床试验。然而，铂疗法的主要局限性依然存在，如耐药性的产生和剂量限制性副作用。为了克服顺铂治疗的弊端，人们尝试探索铂(IV)化合物。以铂(IV)为基础的原药中最突出的代表—沙铂，作为不同癌症类型的单一疗法和联合疗法，正在进行不同的I、II和III期临床试验，但与标准疗法相比，大多数试验都显示出中等或较低的活性。然而，铂(IV)复合物是很有前途的抗癌药物，因为它们具有高稳定性和生物利用度，可以口服应用并克服肾毒性等副作用。铂(IV)络合物必须通过还原激活才能释放出其活性铂(II)代谢物。因此，铂(IV)复合物作为生物还原性原药，可用于治疗缺氧，缩小传统金属疗法和靶向疗法之间的差距。


缺氧是进展期实体瘤的一个重要特征，几十年来一直是传统抗癌疗法面临的挑战。由于包括铂(II)类药物在内的大多数化疗药物都以高度增殖的癌细胞为目标，通常与缺氧相关的强大静止细胞部分几乎不受许多治疗方法的影响。此外，坏死和缺氧区域会在肿瘤组织中产生不均匀性，其物理化学和生物学特性也会发生变化，如pH和pO2梯度以及不同的蛋白质表达模式。这种生物还原环境会影响化疗药物的稳定性，并导致这些药物发生特定的生物转化。在这种情况下，铂(IV)复合物可能比其他治疗方法更具优势，因为铂(IV)复合物必须先还原才能激活药物。然而，迄今为止，有关铂(IV)在缺氧肿瘤中的活化情况的研究还很少。


Hall等人和Mellor等人认为，铂(IV)络合物在实体瘤条件下可能被还原成具有活性的铂(II)对应物。不同的小分子量还原剂，如抗坏血酸、谷胱甘肽或氨基酸，如L-蛋氨酸和L-半胱氨酸，以及蛋白质，如金属硫蛋白和白蛋白，都被认为是体内和体外细胞内和细胞外还原的原因。然而，铂(IV)还原的确切机制仍不清楚，试图研究肿瘤微环境对铂(IV)复合物稳定性的影响也没有完全得出结论。尽管如此，铂(IV)化合物在实体瘤缺氧条件下可能被还原的假说仍在讨论之中，而这一假说的证实还需要更多的实验证据。


本研究特别考察了缺氧对三种在研铂(IV)化合物、其主要铂(II)代谢物以及作为参考化合物的沙铂在不同人体和体外人类癌症模型中活性的影响(图1)。

图1、正在研究的铂(IV)复合物1-3的化学结构，包括作为主要铂(II)代谢物4和参考化合物satraplatin。


所研究的铂(IV)配合物具有相同的赤道配体球，而它们的轴配体则不同，1、2和3的配体分别为反式二羟基、反式二羟基乙酰基和反式二乙酰基。配体球的变化与抗坏血酸和谷胱甘肽存在时的还原率、还原电位和亲脂性不同有关，而可能的铂(II)代谢物和稳定性则相当。这一系列理化性质使这些化合物非常适合作为模型配合物，用于研究在缺氧条件下还原速率对铂(IV)药物抗增殖活性的影响。


首先，在单层和缺氧多细胞球状模型中测试了研究用复合物1-3，以了解其细胞毒性效力对所用细胞培养条件的依赖性。随后，化合物1和2(相对于单层培养物而言，在缺氧球形体中表现最佳)在非缺氧球形体模型、缺氧单层模型和雄性SCID小鼠模型中进行了进一步测试。此外，铂在球体内的分布和细胞积累研究进一步揭示了化合物的行为及其作用模式。


材料与方法


细胞系和培养条件


人类细胞系CH1(通过STR图谱鉴定为Multiplexion的PA-1卵巢畸胎癌细胞)和结肠癌细胞系HCT116(ATCCs CCL-247t)在MEM(补充10%热灭活胎牛血清、1%L-谷氨酰胺、1%丙酮酸钠、1%非必需氨基酸溶液)中生长。人HT1080(ATCCs CCL-121t)纤维肉瘤细胞和CCD-18Co正常结肠成纤维细胞保存在添加10%FCS的MEM(Sigma)中。所有细胞系的单层培养物均生长在经细胞培养处理的75cm2烧瓶中。


球形体培养


对于球形细胞的生产，CH1/PA-1、HCT116和HT1080细胞经胰蛋白酶化从培养瓶中收获，并在MEM中播种，使用未经细胞培养处理的圆底96孔板(VWR)，对于处理前7天直径大于400微米的球形细胞，其密度分别为每孔1×104个(CH1/PA-1)、2×103个(HCT116)和8×103个(HT1080)；对于处理前3天直径小于200微米的球形细胞，其密度分别为每孔1×103个(CH1/PA-1)、0.3×103个(HCT116)和0.3×103个(HT1080)。3×103(HCT116)、0.3×103(HT1080)个有活力细胞。为尽量减少蒸发，最外层的孔不用于球形细胞的培养，而是注入200mL的PBS。培养物在37摄氏度、含95%空气和5%CO2的湿润环境中培养。