讨论：


目前的研究表明，神经炎症、谷氨酸转运体和受体的表达及功能变化参与了吗啡耐受性的形成。具体而言，在吗啡耐受动物的脊髓背角发现促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）释放、星形胶质细胞活化、GLT-1、GS硝化和NMDA受体NR2B亚基的贩运明显增加。腹腔注射HS能显著减轻吗啡对甩尾潜伏期、脉搏波速度和脉搏波速度的影响，且呈剂量依赖性。同时，HS能减少炎性细胞因子的释放，抑制GLT-1和GS的硝化，降低谷氨酸浓度的升高，减少NR1和NR2B的总表达和膜转运。上述数据表明，HS可能是缓解吗啡耐受性发展的一种潜在治疗方法。


很少有研究报告称重复注射吗啡与耐受性有关。弹尾潜伏期或热板试验和VonFrey试验是测试动物对热和机械刺激敏感性的最常用方法。在本研究中，尾弹潜伏期、PWT和PWL的降低表明吗啡耐受大鼠模型已成功建立。我们的数据显示，吗啡在第1天产生了显著的抗痛觉作用，并在第5天诱导了耐受。注射HS能以剂量依赖性的方式增加慢性吗啡给药引起的尾弹潜伏期、脉搏波速度和脉搏波速度的降低。有研究认为HS可抑制吗啡重复给药引起的抗痛作用的降低。对于正常组，即使最大剂量的氢气对行为试验没有影响，氢气对病理状态也有治疗作用，但对正常生理状态没有影响。


脊髓小胶质细胞的激活与神经病理性疼痛的发病机制密切相关。在我们的研究中，观察到重复吗啡给药导致的TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白增强，这与之前的研究结果一致。此外，脊髓GFAP表达明显增加，表明反复鞘内注射吗啡增加了星形胶质细胞的活化。慢性吗啡诱导的神经胶质细胞活化机制尚不十分清楚，研究发现可能与鞘氨醇-1-磷酸（S1P）受体系统有关。S1P受体1的激活可通过NADPH氧化酶诱导超氧化物，当与一氧化氮结合时会导致一系列事件，最终导致星形胶质细胞/小胶质细胞活化，促炎细胞因子的产生增加。在我们的研究中，联合使用氢气可显著降低脊髓TNF-α、IL-1β、IL-6和GFAP的表达，这表明氢气可有效抑制神经炎症。然后测量动脉和静脉中的氢浓度。注射HS后，氢气浓度随时间逐渐升高，在15分钟内达到峰值，然后逐渐降低。同时，动脉血中的氢浓度高于静脉血中的氢浓度，这表明氢部分进入了细胞，起到了抗炎和抗氧化的作用。这是首次有研究表明腹腔注射HS可以减轻慢性吗啡引起的神经炎症，但其潜在机制还需要进一步研究。


星形胶质细胞上表达的GLT-1被认为负责清除突触前膜释放的90%以上的谷氨酸，将谷氨酸转运到星形胶质细胞，然后通过GS将兴奋性谷氨酸转化为谷氨酰胺。本研究发现，与N组相比，M组脊髓中GLT-1、GS的硝化程度和谷氨酸浓度均有所增加。这证实了长期服用吗啡可改变星形胶质细胞谷氨酸转运体的功能，导致谷氨酸平衡失调，增加兴奋毒性。GS酪氨酸残基的硝化导致GS活性失活，降低了谷氨酸转化为无毒谷氨酰胺的能力，增加了神经毒性。与M组相比，M+HS组GLT-1和GS硝化程度及谷氨酸浓度均有所降低，表明在吗啡耐受性大鼠模型中腹腔注射HS可抑制GLT-1和GS硝化，提高星形胶质细胞从突触间隙吸收谷氨酸的能力，减轻神经毒性。与M组相比，GLT-1激动剂缓解了吗啡耐受性，而GLT-1抑制剂不能缓解吗啡反复注射引起的镇痛能力下降，同时给予GLT-1和氢气，也没有进一步缓解吗啡耐受性的发展，说明氢气通过改善GLT-1的功能抑制吗啡耐受性的形成。该研究首次证实氢气能有效抑制GLT-1和GS的功能，为今后治疗和预防吗啡耐受提供了有效途径。


研究证实，NMDA受体在谷氨酸能受体系统中非常重要，与突触可塑性和慢性疼痛的形成密切相关。最近发表的一篇文章显示，NO/NMDA受体对吗啡慢性治疗的抗惊厥作用有介导作用，从而导致小鼠模型对吗啡镇痛作用的耐受性。在本研究中，与N组和V组相比，M组tNR1、mNR1、tNR2B、mNR2B的表达量和m/tNR1orm/tNR2B的比值均有所增加，表明含有NR2B亚基的NMDA受体表达量增加和膜贩运参与了吗啡耐受。与M组相比，腹腔注射HS可抑制总表达和MSNR1和NR2B的膜运输，但对NR1和NR2B在未注射吗啡的正常大鼠中表达。同时服用选择性NR2B拮抗剂可部分缓解吗啡耐受性的发展，而同时服用NR2B抑制剂和HS并不能进一步缓解吗啡耐受性的发展，这表明HS通过抑制NMDA受体的功能来抑制吗啡耐受性的形成。长期服用吗啡诱导NMDA受体表达和迁移的内在机制尚不完全清楚，可能与GLT-1和GS功能受损，导致谷氨酸浓度增加和NMDA受体异常激活有关。


上述数据表明，通过调节NMDA受体的功能，HS可以成为减轻吗啡耐受性的一种潜在治疗策略。


结论：

图7：HS预处理可抑制吗啡反复给药后神经炎症、GLT-1、GS硝化和NMDA受体转运及功能增加。


综上所述，本研究表明，反复鞘内注射吗啡（每次10μg/10μL，每天两次，共5天）可增加TNF-α和IL-1β等炎症因子的水平，释放IL-6，并激活脊髓背侧角的星形胶质细胞。一方面，氢气可增加炎症因子如TNF-α和IL-1β的水平，释放IL-6，激活脊髓背角的星形胶质细胞；另一方面，氢气可引起GLT-1和GS的硝化，增加突触间隙中谷氨酸的浓度，促进含有NR2B亚基的NMDA受体的膜迁移，导致吗啡耐受（图7）。因此，氢气预处理以剂量依赖的方式部分逆转了甩尾潜伏期、PWT和PWL的下降，降低了TNF-α、IL-1β和IL-6的表达、GLT-1、GS的硝化以及膜和总NR1、NR2B的表达，表明氢气通过减少神经炎症、GLT-1和GS的硝化、NMDA受体在脊髓背角的迁移和功能，阻止了吗啡耐受性的形成。氢气预处理可被视为预防吗啡耐受性的一种新型治疗策略。


吗啡的反复鞘内给药一方面增加了TNF-α和IL-1β等炎症因子的水平和IL-6的释放，激活了脊髓背角的星形胶质细胞，另一方面导致了GLT-1和GS的硝酸化表达，增加了突触间隙中谷氨酸的浓度，促进了含有NR2B亚基的NMDA受体的膜贩运，导致了中枢敏化和吗啡耐受。HS预处理可减少炎症细胞因子的增加，抑制GLT-1和GS的硝化表达，减少NMDA受体的膜贩运。因此，HS可能为预防吗啡耐受提供了可能。


氢气电极研究硫化氢预处理、注射富氢盐水能否抑制吗啡耐受性形成（一）

氢气电极研究硫化氢预处理、注射富氢盐水能否抑制吗啡耐受性形成（二）

氢气电极研究硫化氢预处理、注射富氢盐水能否抑制吗啡耐受性形成（三）