摘要


粪肥在农业中被广泛使用，并高度影响了土壤微生物群落，例如氨氧化微生物。然而，关于受粪肥施用影响的稻田土壤中古菌与细菌氨氧化微生物群落的认知仍然很大程度上未知，尤其是长期影响。在本工作中，通过研究两个复合土壤岩心（长期施用粪肥与未扰动对照），调查了粪肥施用对氨氧化微生物种群、相关潜在硝化速率（PNRs）以及控制该影响的关键因素的影响。此外，设计了用NH4+培养5周的土壤实验以验证田间研究。结果表明，施用粪肥土壤中细菌amoA基因的拷贝数显著高于未施用土壤（p<0.05），表明长期粪肥施用对氨氧化细菌（AOB）的种群具有明显的刺激作用。在施用粪肥的土壤岩心中检测到的PNRs（14-218 nmol L-1 N g-1 h-1）显著高于未施用土壤岩心（5-72 nmol L-1 N g-1 h-1；p<0.05）。观察到PNRs与细菌amoA基因拷贝数而非古菌amoA基因拷贝数高度相关，表明与细菌氨氧化微生物相关的强硝化能力。NH4+-N与AOB的丰度显著相关（p<0.01）并解释了96.1%的环境变异，表明NH4+-N是影响AOB种群的主要因素。培养实验证明，两种土壤中细菌amoA基因丰度明显增加（从2.0 x 10^6到8.4 x 10^6 g-1干土重和从1.6 x 10^4到4.8 x 10^5 g-1干土重），而古菌amoA基因则未增加，这与田间观察结果一致。总之，我们的结果表明，无论是长期还是短期使用，粪肥施用促进了细菌氨氧化微生物的种群规模，而非其古菌对应物，且NH4+-N是关键影响因素。


引言


过去几十年，基于铵的氮肥施用显著提高了水稻产量。然而，只有27-33%的施用的氮肥能在植物材料中被回收。在农业生态系统中，硝化作用作为耦合的硝化-反硝化作用的第一步，是氮肥损失的关键步骤。硝化作用，即NH3转化为羟胺，由具有关键氨单加氧酶（AMO）的氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）完成。AOA和AOB独特的生理学和代谢表明，环境因素如pH、有机碳、NH4+可用性和盐度可能决定这两个类群在自然生态系统中的分布和功能重要性。基于培养的研究和针对编码AMO催化亚基A的amoA基因的分子调查已被广泛用于研究施肥对氨氧化微生物的影响。隶属于奇古菌门（Thaumarchaeota）内一个新分支的AOA在各种土壤中在数量上超过了其细菌对应物。然而，关于受粪肥施用影响的稻田土壤中古菌与细菌氨氧化微生物群落的认知仍然知之甚少，尤其是长期影响。


在稻田中，化学和有机肥料的强化施用为原位条件下AOA和AOB的生长提供了充足的底物。此外，沿深度在稻田土壤中形成的垂直铵通量/浓度和氧化还原梯度高度影响了微生境中细菌、真菌和古菌（包括AOA）的结构和功能。这些垂直剖面的变化为研究变化的环境对稻田土壤中氨氧化微生物群落的影响提供了一个便利的系统。


本研究旨在调查稻田土壤中AOA和AOB种群的垂直剖面及其对粪肥施用的响应。为实现这些目标，从一个长期施用粪肥的稻田和一个相邻未施肥且未种植水稻的地点采集了岩心样本。然后进行了为期5周的培养实验，以验证田间研究并调查AOA和AOB响应铵底物添加的动态变化。通过针对amoA基因的定量聚合酶链式反应（qPCR）测定了AOA和AOB的丰度。同时测量了土壤性质和PNRs。将土壤化学性质与AOA和AOB丰度之间的关系进行相关性分析，以找出控制其种群大小的关键因素以及AOA和AOB在稻田土壤硝化作用中的推定贡献。


材料与方法


采样地点与采样

样本取自中国南方浙江省嘉兴市一个典型水稻种植区的稻田。在一个水稻-小麦轮作系统中，粪肥施用（生长季节的4月至每月两次）已持续20多年。粪肥主要由牲畜废物（包括尿液、粪便和冲洗水）构成，这些废物主要在邻近农场发酵，并通过两个渠道输入稻田。粪肥含有高铵态氮（NH4+-N）和化学需氧量（COD；表1）。其中，铵占全氮（TN）含量的49-60%。选择一个相邻未受粪肥影响且未种植水稻的地块作为对照。土壤样本于2009年11月收获后（无水淹条件下）从0-100厘米深度采集。从每个地块取三个土壤岩心（直径约5厘米），将同一深度（每10厘米间隔）的样本混合形成一个复合样本。样本在运输到实验室时密封在无菌塑料袋中并置于冰上。一部分在4°C储存用于培养实验，另一部分通过2.0毫米筛用于土壤特性分析。其余部分在-80°C储存用于DNA提取和下游分析。


化学性质与潜在硝化速率测量


土壤中的铵、亚硝酸盐和硝酸盐用2 M KCl提取缓冲液提取，并通过连续流动分析仪（Skalar+Analytical,The Netherlands）测量。土壤pH用土水比1:2.5测定，并用PB-10 pH计（Sartorius,Germany）测量。土壤有机质（TOM）和TN根据标准方法测定。每个测量进行三次重复。新鲜土壤中的氧气浓度使用OXY Meter S/N 4164不锈钢电极传感器（Unisense,Denmark）原位测量。潜在硝化速率的测量根据先前报告使用氯酸盐抑制法进行。简而言之，将5.0克土壤加入含有20毫升磷酸盐缓冲溶液（PBS;g/L:NaCl,8.0;KCl,0.2;Na2HPO4,0.2;NaH2PO4,0.2;pH 7.4）和1 mM(NH4)2SO4的50毫升离心管中。加入终浓度为10 mM的氯酸钾以抑制亚硝酸盐氧化。悬浮液在25°C的黑暗培养箱中培养。亚硝酸盐用5毫升2 M KCl溶液提取，并通过分光光度计在540 nm波长下用N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐测定。表观潜在硝化速率根据前6小时内NO2-N浓度的线性增加计算。