3.结果与讨论

选择具有良好导电性和生物相容性的碳纤维作为基底制备功能化微电极（CFME）（图1A）。通过原位电沉积在CFME表面形成致密金微片（记为AuS/CFME）（图1B和C）。在0.01 mol·L⁻¹H₂SO₄中，AuS/CFME的循环伏安（CV）曲线在约0.9 V（vs.Ag/AgCl）处出现还原峰（图1D），可用于计算电荷消耗量。电极的电化学活性面积可通过以下公式估算：

A = Q/386

其中Q为消耗电荷，单位面积清洁金电极的Q值为386μC·cm⁻²。计算得AuS/GO的电化学活性面积为0.05 cm²，约为裸CFME几何面积的7.8倍。在1.0 mmol·L⁻¹K₃[Fe(CN)₆]中的CV曲线（图2）显示“S”形特征电流峰，表明其具有典型微电极特性。此外，AuS/CFME的极限扩散电流比裸CFME高2.4倍，这可能源于增大的电化学活性面积（图2曲线b）。

先前研究表明，在生理条件下，硫醇配体可能被丰富的生物硫醇（如谷胱甘肽GSH）取代，导致检测失真和分子在金表面吸附不稳定。为解决该问题，近年来开发了Au-C≡C键合法以增强分子在电极表面组装的稳定性。因此，选择在适配体3′末端修饰炔基，以高稳定性固定于AuS/CFME。同时，在适配体5′末端修饰二茂铁（Fc）作为电化学响应信号，间接反映K⁺浓度变化。为合理调节适配体电化学传感器的响应范围以适应脑内应用，设计了三种不同链长的适配体并固定于金纳米颗粒修饰的CFME。相应的修饰微电极分别记为SAC（Fc-5′-TTTGGTTGGTGTGGTTGGTTT-3′-C≡C-H）、MAC（Fc-5′-TTTGGTTGGTGTGGTTGGTTTTTTTTTTTTT-3′-C≡C-H）和LAC（Fc-5′-TTTGGTTGGTGTGGTTGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′-C≡C-H）。通过红外光谱（图3）追踪适配体探针在AuS/CFME上的修饰情况。适配体中C-O键、C=O键和-OH的出现表明适配体已成功修饰于AuS/CFME。

接下来，采用高灵敏度的差分脉冲伏安法（DPV）追踪修饰过程。如图4所示，在aCSF溶液（pH 7.4）中，SAC修饰的AuS/CFME在0.22 V（vs.Ag/AgCl）处出现阳极峰，归因于Fc氧化为Fc⁺。Fc/Fc⁺的阳极电流信号强烈依赖于链长，SAC电极电流响应最大（曲线a），但随着适配体链长的增加，电流响应逐渐减小（曲线b和c）。这些结果表明，较长的适配体修饰链导致Fc/Fc⁺与电极表面距离增加，从而减弱电流响应。

随后，在不同K⁺浓度溶液中获取不同适配体电极的DPV曲线。如图5所示，SAC电极的峰值电流密度（Jp）随K⁺浓度增加而逐渐增大。MAC和LAC电极也观察到类似的电流随K⁺浓度增加的趋势。然而，三种适配体微电极对K⁺浓度的线性响应范围不同：SAC为0.3 nmol·L⁻¹–100 nmol·L⁻¹（图4B），MAC为3.0 nmol·L⁻¹–10μmol·L⁻¹（图4D），LAC为10μmol·L⁻¹–10 mmol·L⁻¹（图4F）。这些结果表明，适配体电极的响应强烈依赖于K⁺浓度，增加适配体链长可合理调节电化学传感器对更高浓度水平的灵敏度。由于脑细胞外K⁺基础浓度约为2.6 mmol·L⁻¹，最终优化选择LAC作为电化学传感器用于活体脑内K⁺检测。

电化学传感器的选择性对于复杂脑环境中的体内应用至关重要。我们针对实际脑系统中共存的各种物质（包括金属离子（Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Al³⁺）、生物物种（AA、DA和UA）及氨基酸（Cys、Gln、His和Arg））进行了LAC的选择性和竞争性测试。结果表明，所有干扰物的响应均小于3.5%（图6），证明适配体修饰微电极具有高选择性。此外，还研究了电极的稳定性。将两种分别修饰炔基和巯基适配体的微电极浸入GSH溶液（5 mmol·L⁻¹）中模拟活体脑环境（图7A）。发现炔基修饰微电极在浸泡8 h后仍保持96.4%的灵敏度，而巯基修饰电极仅剩76.4%。结果表明炔基修饰法可有效抵抗其他富硫醇物质的干扰。接下来，还在不含K⁺的人工脑脊液（aCSF）中测试了炔基修饰微电极LAC的时间稳定性。结果表明，LAC在aCSF中连续浸泡12 h后仍保持96.3%的灵敏度，证明LAC电极具有高稳定性（图7）。

为验证体内检测的可行性，使用优化后的LAC记录小鼠海马区在缺氧10 min前后细胞外K⁺浓度的变化（图8A）。发现随着小鼠脑缺氧开始10 min，海马区K⁺浓度从2.6 mmol·L⁻¹升至8.7 mmol·L⁻¹（图8B和C）。这种变化可能源于缺氧环境下脑细胞去极化。为验证LAC电极测试结果的可靠性，我们还采集了小鼠海马区脑脊液样本并使用血气分析仪测试，发现LAC电极与血气分析仪测得的K⁺浓度差异小于4%，证明所开发的LAC微电极具有高准确性。

4.结论


本研究设计并应用了线性范围可控的适配体修饰微电极，用于活体脑中K⁺的实时检测。设计了三种不同链长的K⁺适配体，其中3′末端炔基用于锚定适配体探针于电极表面，5′末端二茂铁作为电化学响应信号反映K⁺变化。发现随着适配体链长的增加，微电极对K⁺检测的线性响应范围逐渐向高浓度移动。具有最长修饰链的LAC在10μmol·L⁻¹–10 mmol·L⁻¹范围内呈现线性响应，满足实际活体脑检测需求。最终，LAC成功应用于缺氧后小鼠脑内K⁺的体内检测。所开发的合理调节适配体修饰传感器响应范围的策略，可能为拓宽适配体传感器在不同测量系统（尤其是脑分析）中的应用开辟新途径。