摘要


钾离子（K⁺）广泛参与多种生理病理过程，其异常变化与脑缺血等脑部疾病的发生密切相关。在体内获取K⁺的变化对于理解K⁺在大脑功能中发挥的作用具有重要意义。本研究开发了一种基于单链DNA适配体的微电极，用于高选择性检测脑内K⁺。该适配体探针设计包含三个部分：用于特异性识别K⁺的适配体序列、用于稳定固定探针于金表面的末端炔基，以及作为电化学响应信号的二茂铁氧化还原活性基团。通过改变适配体探针的链长度，可合理调节微电极的响应范围。优化后的电极LAC具备高选择性，线性范围为10μmol·L⁻¹至10 mmol·L⁻¹，满足脑内K⁺检测需求。最终，该微电极成功应用于缺氧条件下活体小鼠脑中K⁺的检测。


1.引言


作为细胞内液的主要阳离子，钾离子（K⁺）广泛参与神经信号传递及脑内氧化还原等生理病理过程。K⁺浓度的异常变化可能与多种脑疾病（如脑缺血和脑出血）密切相关。目前，K⁺的检测方法包括原子吸收光谱、原子发射光谱、荧光光谱等，但这些方法难以实现脑内K⁺的活体检测。基于可植入微电极的电化学方法因具有高时空分辨率的特点，被广泛用于体内离子监测。然而，K⁺的外部电子结构与钠离子（Na⁺）相似，且细胞外Na⁺浓度是K⁺的30-50倍，因此在活体动物中高选择性识别与检测K⁺仍面临巨大挑战（见Scheme 1）。


适配体是单链寡核苷酸分子，可通过体外筛选高选择性结合多种目标分析物（包括离子、小分子、蛋白质、肽段乃至整个细胞）。通过适配体与离子结合后触发空间折叠，并基于电化学响应元件与电极表面距离变化引起的信号变化，已成功实现K⁺的选择性检测。然而，已开发的基于适配体的电化学离子传感器线性范围通常为nmol·L⁻¹至μmol·L⁻¹，无法满足活体大鼠脑中K⁺浓度（约mmol·L⁻¹）的检测需求。因此，如何调节适配体电极的响应范围以适应体内应用仍具挑战性。


为应对这些挑战，本研究设计并制备了一种线性范围可控的适配体修饰微电极，通过合理调节响应距离实现活体脑中K⁺的实时检测。适配体序列TTTGGTTGGTGTGGTTGGTTT用于特异性识别K⁺，其5′末端修饰二茂铁（Fc）作为电化学氧化还原基团，3′末端修饰炔基以稳定固定于金颗粒修饰的碳纤维电极表面。识别并捕获K⁺后，适配体发生空间折叠，使Fc基团更接近电极表面，从而增加法拉第电流响应。另一方面，通过设计不同链长的适配体变体，调节K⁺结合后Fc与电极表面的距离，有效改变了微电极的线性范围，使其适用于脑内活体检测（Scheme 1）。最终，基于可调谐电化学传感器，我们成功实现了缺氧条件下小鼠脑中K⁺的测量。


2.实验部分


2.1.化学品与试剂


碳纤维购自Tokai Carbon公司（日本Tokai）。AuCl₃·HCl·4H₂O、K₃[Fe(CN)₆]、NaCl、CaCl₂、KCl、MgCl₂·6H₂O、CuCl₂·2H₂O、FeCl₃·6H₂O、ZnCl₂、AlCl₃·6H₂O、抗坏血酸（AA）、多巴胺（DA）、尿酸（UA）、半胱氨酸（Cys）、谷氨酰胺（Gln）、组氨酸（His）和精氨酸（Arg）购自阿拉丁化学有限公司（中国上海）。人工脑脊液（aCSF）粉末购自Adamas-Beta（中国上海）。C≡C-H和二茂铁（Fc）双修饰适配体由上海DNA生物科技有限公司合成。序列选择如下：


•SAC：Fc-5′-TTTGGTTGGTGTGGTTGGTTT-3′-C≡C-H


•MAC：Fc-5′-TTTGGTTGGTGTGGTTGGTTTTTTTTTTTTT-3′-C≡C-H


•LAC：Fc-5′-TTTGGTTGGTGTGGTTGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′-C≡C-H


2.2.微电极制备


碳纤维微电极（CFME）按先前方法制备，使用前浸泡于丙酮中清洁表面。随后，在0.1 mol·L⁻¹HAuCl₄溶液中于-0.2 V（vs.Ag/AgCl）电沉积10 s，在金微片表面修饰CFME。电极用水冲洗去除附着溶液后，在N₂气氛下干燥6 h。


2.3.适配体在电极表面的固定


将C≡C-H和Fc双修饰适配体配制成100μmol·L⁻¹水溶液，通N₂除去溶解氧。将制备的AuS/CFME浸入适配体溶液中，于60°C反应6 h以固定适配体。


2.4.活体小鼠脑缺氧实验


所有动物实验均遵循中国科学技术部《实验动物护理和使用指南》，并经华东师范大学动物护理与使用委员会批准（批准号：m+R20190304，中国上海）。为检测活体小鼠海马区K⁺，C57BL/6小鼠用2%异氟烷麻醉后固定于脑立体定位仪，剪开头皮清除结缔组织。以前囟为参考点（AP=-1.30 mm,L=0.75 mm,V=1.25 mm）钻孔，将微电极小心植入脑内。缺氧实验通过将小鼠置于通有混合气体（5%O₂和95%N₂）的自制气密箱中进行。