摘要


阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)会导致睡眠期间间歇性缺氧(IH)。肥胖和OSA都与胰岛素抵抗和全身炎症有关，这可能是组织缺氧造成的。我们假设，缺氧暴露模式决定了外周组织的氧概况和全身代谢结果，而肥胖具有调节作用。将瘦小和肥胖的C57BL6小鼠间歇性缺氧12小时60次/小时(IH60)[吸入氧气分数(FIO2)21-5%，60/小时]、12次/小时(FIO2-5%，15秒，12/小时)、持续性缺氧(SH；FIO2-10%)或禁食时的常缺氧。测量了肝脏、骨骼肌和附睾脂肪中的组织氧分压(PtiO2)、血浆瘦素、脂肪连素、胰岛素、血糖和脂肪肿瘤坏死因子-a(TNF-a)。在瘦小鼠中，IH60会导致肝脏中的氧波动，而肌肉中的PtiO2波动减弱，脂肪中的PtiO2波动消失。在肥胖小鼠中，肝脏基线PtiO2低于瘦小鼠，而肌肉和脂肪的PtiO2没有差异。在IH期间，肥胖小鼠和瘦小鼠的PtiO2相似。所有缺氧方案都会导致胰岛素抵抗。在瘦小鼠中，缺氧会显著增加瘦素，尤其是在SH期间(44倍)；IH60(而非SH)会诱导脂肪分泌的TNF-a增加2.5至3倍。肥胖与瘦素和TNF-a的显著增加有关，而瘦素和TNF-a的增加压倒了缺氧的影响。总之，IH60导致肝脏和肌肉的氧波动以及脂肪的稳定缺氧。IH和SH会诱发胰岛素抵抗，但只有IH60会加重瘦小鼠的炎症。肥胖会导致严重的炎症，但急性缺氧疗法不会加剧炎症。


引言


间歇性缺氧是阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)的一个明显特征，被认为是代谢功能障碍发生和发展的一个主要因素。然而，尽管有大量关于代谢和心血管结果的文献，但人们对间歇性缺氧时组织氧分压(PtiO2)的变化几乎一无所知。


大多数OSA患者都很肥胖。肥胖本身会导致胰岛素抵抗、2型糖尿病、全身炎症、氧化应激和不良的心血管后果。脂肪组织缺氧与肥胖导致的胰岛素抵抗和全身炎症有关。肥胖者脂肪组织中的氧含量明显低于正常体重者。其他胰岛素敏感组织(如肝脏和骨骼肌)中的氧含量尚未在肥胖者和瘦弱者中进行比较。


本研究的作者们建立了一种间歇性缺氧小鼠模型，再现了OSA患者夜间的血氧状况，并证明慢性间歇性缺氧会诱发小鼠的胰岛素抵抗、全身炎症和氧化应激。然而，人们对OSA和间歇性缺氧的多个方面仍然知之甚少。OSA的代谢结果与疾病的严重程度相关，但这种关系在动物模型中尚未得到充分研究。在相同的间歇性缺氧频率下，SpO2(脉搏血氧饱和度测量法测量的血氧饱和度)的最低点越严重，肝脏氧化应激和血脂异常越严重，但间歇性缺氧频率对组织氧气水平和代谢结果的影响尚未在动物模型中进行系统研究。


在本研究中，瘦小鼠和肥胖小鼠暴露于两种不同的间歇性缺氧方式：12次/小时和60次/小时，以及持续缺氧，并测量了1)血液、肝脏、肌肉和附睾脂肪中的实时氧含量；2)胰岛素抵抗指标，包括空腹血糖和血浆胰岛素水平，以及影响胰岛素抵抗的脂肪因子、瘦素和脂肪连通素的水平；3)氧化应激和炎症指标。我们选择了研究人员常用的间歇性和持续性缺氧方案。


我们假设，缺氧暴露方案决定了外周组织的氧概况和全身代谢结果，而肥胖具有调节作用。


方法


实验动物。研究共使用了143只6至8周大的雄性瘦C57BL/6J小鼠，这些小鼠购自杰克逊实验室。72只小鼠用于检测所有报告的代谢变化、氧化应激和炎症。48只动物用于免疫印迹和缺氧探针的免疫组织染色。23只小鼠仅用于评估动脉血和代谢活跃组织中的氧含量。瘦小鼠食用普通饲料，而肥胖小鼠食用高脂肪饲料(TD03584，5.4千卡/克，脂肪含量35.2%，58.4%的千卡来自脂肪)。小鼠饲养在光-暗调节的环境中，从上午9点到晚上9点为12小时的光照阶段。所有测量均在小鼠25-30周龄时进行。


实验设计。本研究的作者开发了一种小鼠间歇性缺氧模型，如前所述。简而言之，他们设计了一个气体控制输送系统来调节进入笼子的室内空气、氮气和氧气的流量。在间歇性缺氧60次/小时期间，吸入的氧气分数在30秒内从20.9%降至5%，然后在随后的30秒内复氧至室内空气水平，结果每小时发生60次缺氧事件。在每小时12次的间歇性缺氧过程中，吸入的氧气分数在20秒内从20.9%降至5%，随后的15秒内保持在5%，然后迅速复氧至室内空气水平。这种循环每5分钟重复一次，结果每小时发生12次缺氧事件。在持续的等压低氧状态下，吸入氧气的比例持续降低到10%。正常缺氧小鼠持续暴露于室内空气中。除评估氧曲线外，所有测量都是将小鼠暴露在常氧、间歇性缺氧12次/小时、间歇性缺氧60次/小时或持续缺氧环境中一个晚上(12小时)，同时禁食。暴露结束前30分钟，通过尾部放血测量未麻醉小鼠的血糖。暴露结束后，立即用1-2%的异氟醚对小鼠进行麻醉，并获取血液、肝脏、肌肉和附睾脂肪以进行进一步分析。第二组是11只瘦小鼠和12只肥胖小鼠，它们以前没有进行过缺氧调节，在不同的缺氧方案中，使用快速反应氧微电极(OX-50，UnisenseA/S，直径50μm，90%反应时间＜5秒)测量肝脏、肌肉和附睾脂肪中的PtiO2，同时使用小鼠领夹进行无创脉搏血氧测量。根据制造商的协议，在对每只动物进行测量之前和之后都要对氧微电极进行校准。在此过程中，小鼠腹腔注射1.5克/千克尿烷进行麻醉。将小鼠的鼻子从一个孔中放入与第一组小鼠相同的笼子中。然后切开不同组织上的皮肤，以便用探针测量组织含氧量。将氧微电极安装在微型机械手上，垂直插入距表面2毫米处，然后稍稍回缩至可获得稳定PtiO2信号的位置。在将氧微电极移动到同一组织的不同位置或不同组织之前，按上述方法进行所有三种缺氧方案和常氧方案的测量，并在同一位置进行记录。正常缺氧和持续缺氧的测量时间至少为2分钟，间歇性缺氧的测量时间至少为5分钟。总体而言，每只实验动物都进行了多次测量(三种组织的四种实验方案)。


缺氧探针。缺氧探针的免疫组化染色是根据生产商提供的试剂盒进行的。简而言之，在组织采集前30分钟，按60mg/kg体重腹腔注射Hypoxyprobe-1，同时继续暴露于低氧或常氧环境中。新鲜组织用10%缓冲福尔马林固定，乙醇脱水，石蜡包埋。使用与FITC结合的Hypoxyprobe-1一抗和与辣根过氧化物酶结合的抗FITC二抗进行免疫组织染色。为了进行Western印迹，将新鲜肝脏、肌肉和附睾脂肪立即冷冻在液氮中。使用Bio-Rad预制凝胶系统进行SDS-PAGE和Western印迹。蛋白质(20μg)用于每个泳道。我们使用Hypoxyprobe-1抗体作为一抗。


生物化学。空腹血浆总胆固醇和甘油三酯、血糖用试剂盒检测。血浆胰岛素和瘦素、脂肪连素使用ELISA试剂盒进行检测评估。丙二醛用检测试剂进行测量。为了测量体内肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的分泌，将附睾脂肪组织片段在含有1%BSA的M199培养基中培养3小时。用ELISA试剂盒评估培养基中的TNF-a水平。在进行实时聚合酶链反应(PCR)时，使用TRIzol从肝脏中提取总RNA，并使用Advantage RT for PCR试剂盒合成互补DNA。使用特异于TNF-a的引物和探针进行实时逆转录酶PCR，如前所述。mRNA表达水平通过标准ΔΔCt方法(http://www.ambion.com/techlib/basics/rtpcr/index.html)与18S核糖体RNA浓度进行归一化，如我们实验室之前所做的那样，然后表示为相关样本中mRNA与常氧小鼠平均mRNA水平的比值。


数据分析。分析使用Stata 9.0版本进行。数据以均值±SE表示。使用两样本Wilcoxon秩和(Mann-Whitney)检验比较瘦小鼠和肥胖小鼠的血氧水平。氧水平平均方差的比较采用Wilcoxon符号秩检验。在瘦或肥胖表型中，低氧和常氧条件下代谢和炎症指数的比较采用非配对t检验。瘦小鼠和肥胖小鼠之间代谢和炎症指标的比较采用一般线性模型方差分析。P值小于0.05为差异显著。