结果与讨论


球体内缺氧特征


球形体是一种体外肿瘤模型，与体内肿瘤有一些共同特征，如增殖和营养梯度、慢性缺氧和坏死。以前曾分别用HIF-1a免疫荧光法和PI染色法观察过直径为>400μm的球体(又称"缺氧球体"或"缺氧3D球体")的缺氧区域和坏死核心。获得的图像显示球核内有大量坏死，并显示轻度缺氧区域从球表面下30毫米的深度开始。然而，直径为200微米以下的球体没有缺氧或坏死的迹象，因此被称为"非缺氧球体或非缺氧3D"。


现在继续对活体球体内的缺氧环境进行表征。为此，采用侵入式微电极技术测量了大于400μm大球体内的氧气分布。其他作者发表的用微电极测量活体球体内氧分压的尝试遇到了一些技术问题，并提出了需要批判性讨论的问题。例如，Mueller-Klieser等人报告的稳态测量每步耗时1分钟，每个球体的总测量时间为20分钟。在这段时间内，被动扩散很可能会影响数据。为了绕过这个问题，我们使用了新型技术设备，每步测量可在4秒内完成，每个球面的总测量时间约为1.5分钟。

图2、通过琼脂糖包埋的HT1080和CH1/PA-1多细胞球体(直径>400μm)与远离球体的琼脂糖培养基的物理化学梯度比较，由微电极测量并以代表性样本为例。(A)氧分布(以20μm为间隔测量)，(B)pH值(以40μm为间隔测量)，(C)氧化还原电位(以40μm为间隔测量)。剖面深度是相对于琼脂糖表面而言的，因此球体相对于琼脂糖表面的位置各不相同。


如HT1080和CH1/PA-1球形细胞所示(图2A和ESI†)，我们的研究结果表明，氧梯度向球形细胞坏死核心移动，球形细胞中心的氧分压最低。这些结果与其他作者发表的数据非常吻合。对所有调查的细胞系和样本(每个细胞系至少9个样本)都监测到了相似的模式；但观察到绝对值因细胞系而异，因此也因球形体的紧密度而异，而且同一细胞系的球形体之间也存在个体差异。图2显示了HT1080和CH1/PA-1球形细胞的示例结果。实验装置要求固定样本并保持湿度和温度；为此，样本被嵌入琼脂糖中。球体周围的氧含量已明显下降，但不含球体的琼脂糖剖面测量结果(此处用作阴性对照)却没有出现这种情况，该结果仅显示琼脂糖深层的氧含量下降非常缓慢。


缺氧通常伴随着pH值的显著下降(酸中毒)，这在实体瘤和多细胞球体内经常可以观察到。由于pH值是影响大多数化疗药物稳定性的一个主要因素，我们采用微电极法研究了样本中是否存在pH值梯度以及在多大程度上可以测量到这种梯度。结果表明，pH梯度沿氧分布模式向球形中心延伸，但几乎没有向球形周围延伸(图2B和ESI†)。观察到的球形体表面与球形体中心之间的pH值差约为0.2个pH单位，这与其他作者之前发表的结果非常吻合。pH值曲线可大致反映出球形体的尺寸(>400μm)，而氧气梯度更平坦，且更多地延伸到周围的琼脂糖中，这很可能是由于有活力的球形体持续消耗氧气后产生的扩散作用。


此外，据报道，缺氧会导致单层生长的癌细胞的还原电位显著下降。虽然预计球核中的大量缺氧也会导致还原电位显著下降，但迄今为止还没有相关测量报告。为了评估所使用的球粒模型中的氧化还原电位，我们在活体球粒中进行了微电极测量。我们的数据显示，氧化还原电位向球体中心显著下降，这与氧气和pH值的分布模式相似(图2C和ESI†)。遗憾的是，实验装置无法区分细胞内和细胞外区域。总体而言，氧含量、pH值和还原电位的降低强调了球体内还原环境的存在，其中以坏死核心最为明显(图2和ESI†)。


抗增殖活性


研究癌症细胞系的抗增殖活性是探索实验化合物抗癌潜力的关键第一步。因此，我们使用对铂(II)类药物敏感性不同的细胞系，包括CH1/PA-1卵巢畸胎癌(最敏感)、HCT116结肠癌(中度敏感)和HT1080纤维肉瘤(不敏感)细胞，在不同的缺氧和非缺氧细胞培养模型中研究了化合物1-4和沙铂的细胞毒性，并将它们与奥沙利铂(l-OHP)(之前发表的数据)进行了比较。第一步，通过阿拉玛蓝检测法确定缺氧球形细胞和非缺氧单层培养细胞的IC50值。在非缺氧单层培养物中，所有复合物对敏感细胞株CH1/PA-1的活性最高，IC50值大多在低微摩尔范围内，而对耐药细胞株HT1080的活性最低。一般来说，复合物在所有三种细胞系中的活性按以下顺序增加：1<4<2<3<沙铂<l-OHP，表明参考化合物沙铂和奥沙利铂在单层培养中的细胞毒性最强。研究化合物1-3的顺序与这些物质的亲脂性非常吻合，1的亲脂性最小，3的亲脂性最大。这些数据与之前公布的结果非常吻合。在CH1/PA-1细胞系中的数值与参考文献38中公布的数值略有不同，这可能是由于使用了一种名为"CH1/PA-1"的药物。38中的数值略有不同，这可能是由于使用了不同的试剂对有活力的细胞进行染色(MTT与阿拉玛蓝)。


在缺氧球体(3D)模型(直径为>400μm的球体，HIF1a和PI染色阳性)中，细胞毒性的程度因化合物而异。在CH1/PA-1球形模型中，化合物1-4的活性转移到更低的IC50值，而沙铂和奥沙利铂则受到负面影响。这些结果突显了细胞系CH1/PA-1的敏感性，因为在敏感性较低的细胞系HT1080和HCT116中，大多数IC50值都会升高，只有HT1080细胞中的1例外。在比较三维CH1/PA-1模型中获得的结果和还原速度时，可以明显看出，还原速度较慢的物质1(系数6.8)的细胞毒性效力最大，而还原速度较快的物质2和3(系数分别为1.6和1.7)在缺氧条件下只显示出轻微的激活作用。虽然在敏感性较低的细胞系HT1080和HCT116中，所有细胞毒性效力都受到了负面影响，但各因子的下降顺序相似：1(因子1.3和0.6)>2(因子0.7和0.3)>3(因子0.4和0.1)。


令人惊讶的是，铂(II)物种(4)在CH1/PA-1球形模型中显示出1.6倍的活化作用，而沙铂和奥沙利铂的细胞毒性则有所减弱。由于该化合物中的铂已经处于活性较高的氧化态+II，因此在CH1/PA-1模型中观察到的复合物4的活化现象无法用还原来解释。但值得注意的是，铂(II)参比化合物奥沙利铂(l-OHP)并没有表现出类似的活化作用。奥沙利铂和4之间最重要的结构差异在于离去基团：一个草酸螯合基团，而不是两个氯化物。在铂(II)中心与DNA结合之前，这些初始配体必须通过水合作用释放出来。因此，受这些配体影响的吸水速率可能是复合物4活化的一个可能原因。Knox等人之前发表的研究结果支持了这一假设，即顺铂的水解速度是奥沙利铂的112倍。此外，pH值以及三维模型中的pH值梯度对铂(II)的水解过程及随后的DNA结合至关重要，因为有报道称，当pH值大于8时，水溶液会转化为活性较低的羟基，而pH值小于8时，结合动力学会增加。

表1、复合物1-4、沙铂和奥沙利铂(l-OHP)在缺氧球状(三维)模型和非缺氧单层(二维)模型中的细胞毒性，通过阿拉玛蓝检测法测定(暴露时间96小时)。


由于奥沙利铂作为铂(II)参比化合物，在三维实验中的细胞毒性与二维实验中的细胞毒性相比，IC50值增加了10倍(表1)，因此我们假设，观察到的铂(IV)原药细胞毒性活性的增加可能反映了它们被还原激活。为了支持这一观点，我们选择了化合物1(还原率和亲脂性最低)和化合物2(还原率和亲脂性居中)，它们是在所有研究细胞系的缺氧球形体中按活化顺序排列的表现最好的化合物，因此我们选择它们在非缺氧球形体、缺氧单层培养以及缺氧异种移植中进行进一步研究。

表2、化合物1和2在缺氧与非缺氧球体以及缺氧与非缺氧单层培养中的细胞毒性


出乎意料的是，单层培养中的缺氧不会引起敏感细胞株CH1/PA-1中化合物的活化，而在不太敏感的细胞株HT1080和HCT116中IC50值会增加，与缺氧球形培养中的IC50值相当(图3和表2)。这些结果凸显了单层培养和球形培养中缺氧的区别，单层培养细胞得到适当的营养供应，对缺氧表现出早期反应，但没有坏死或凋亡的迹象，也没有其他pH分布和蛋白质表达模式。

图3、化合物1和2在缺氧与非缺氧球形细胞和缺氧与非缺氧单层细胞中的细胞毒性。(A)1在CH1/PA-1细胞中的浓度效应曲线。(B)2在HT1080细胞中的浓度效应曲线。


在CH1/PA-1的非缺氧球形模型(直径为约200毫米的球形体，HIF1a和PI染色阴性)中，1的IC50值介于单层培养和缺氧球形体中的IC50值之间(缺氧2D>非缺氧2D>非缺氧3D>缺氧3D)(图3)。与单层培养相比，2在缺氧和非缺氧CH1/PA-1球体内的IC50值相当，表明这两种化合物在两种球体模型中都有活化作用(表2)。1和2在非缺氧HT1080球形细胞中的情况也是如此，后者的IC50值与缺氧球形模型中的IC50值相当。然而，在HCT116细胞中，非缺氧球形细胞中的IC50值与单层培养中的IC50值相当。总的来说，这些观察结果与在低氧球形培养基中获得的结果一致，再次表明与HCT116和HT1080细胞相比，CH1/PA-1细胞具有较高的敏感性，而且活化顺序相似：1≥2。