化合物


化合物(1、2、3、4、沙铂和奥沙利铂(l-OHP))等所有铂(IV)化合物都溶解在MEM中，制成2mM的储备溶液，然后在MEM中稀释到所需浓度。顺铂和4在使用前不久溶解在MEM中，浓度为0.4mM，然后在MEM中进一步稀释。


阿拉玛蓝测定


对于单层细胞的测试，CH1/PA-1、HCT116和HT1080细胞在处理前24小时从培养瓶中胰蛋白酶化收获，并在MEM中播种到96孔微量培养板(Falcon)中，密度分别为每孔1×103个(CH1/PA-1)、2×103个(HCT116)、3×103个(HT1080)存活细胞。在三维培养物中进行试验时，直接在培养板中处理直径符合要求的球体。


在处理单层和球形细胞时，制备受试化合物的储备溶液并逐步稀释以获得稀释系列。每孔加入100mL稀释液，然后在37℃和5%CO2下培养96小时。配制440mM(E110mg mL1)的复氮脲酸钠(Sigma Aldrich)PBS新鲜溶液，每孔加入20mL。在37℃和5%CO2下染色4小时(单层实验)或过夜(球形实验)。


ICP-MS


化学品。ICP-MS测量的所有稀释液均使用Milli-Q水。硝酸在石英亚沸点蒸馏装置中进一步净化。用于ICP-MS测量的铂和铼标准物质购自CPI International。Tissue-Tek培养基用于包埋冷冻切片。所有其他试剂和溶剂均来自商业渠道，使用时无需进一步纯化。


ICP-MS测量。使用ICP-MS仪器测定了球体内和小鼠组织中的总铂含量。ICP-MS仪器配有CETAC ASX-520自动进样器和MicroMist雾化器，样品吸收率约为每分钟0.25毫升1。每天对仪器进行调试，并将铼作为铂的内标，以考虑仪器波动和基质效应。仪器参数见表4。数据处理使用Agilent MassHunter软件包。


在使用LA-ICP-MS进行生物成像时，使用三重四极杆ICP-MS Agilent 8800记录数据，仪器参数见表4。


积聚研究样品制备(ICP-MS)。用20mM的化合物1-4处理球形体4小时，然后收获并转移到1.5mL Eppendorf管中(每管10个球形体，平均直径450毫米)。用1mL PBS冲洗3次后，用400mL HNO3裂解球形体1小时，然后用Milli-Q水灌至最终体积为8mL。使用表4中列出的仪器参数，用ICP-MS测定铂的总含量。


用ICP-MS测定小鼠组织中的铂浓度。使用微波系统Discover SP-D用亚沸腾硝酸消化小鼠组织样本(肿瘤、肾、肝、肺、肌肉)和血液颗粒。使用的微波参数如下：温度：200℃；斜坡时间：4分钟；保持时间：6分钟：消化后的样品用Milli-Q水稀释，使硝酸浓度低于3%，铂浓度低于15纳克g1。使用ICP-MS测定总铂含量，仪器参数见表4。


利用LA-ICP-MS对多细胞球和小鼠肿瘤样本进行生物成像。用1-5mM(亚毒性浓度)化合物处理96小时后，收获球体并将其转移到1.5mL Eppendorf管中(每管10-20个球体)，然后用PBS冲洗3次。最后一次洗涤后，完全去除PBS，在Eppendorf管中小心地注入0.5-1mL Tissue Tek(Sakura)，然后在80℃下冷冻。用1mL胰盼蓝标记球形细胞。取出皮下异种移植物并冷冻至80℃。为了进行LA-ICP-MS测量，使用冷冻切片机将样本冷冻切成厚度为20毫米的薄片，放在玻璃载玻片上并风干。用苏木精-伊红(H&E)染色各器官5毫米的连续切片，用于组织学评估。


使用波长为213nm的Nd:YAG固体激光器来获取铂金在球体和肿瘤切片中的空间分布。测量前生成了感兴趣区域的光学样本图。为确保样品材料的完全消融，对每个样品的输出激光能量进行了单独调整。消融采用平行线扫描，线与线之间的间距为10毫米。对于肿瘤切片，频率为10Hz，光斑大小为70mm，扫描速度为40mm/s；而对于球形样本，激光参数调整为20Hz，光斑大小为10mm，扫描速度为10mms1。烧蚀的样品材料以每分钟400毫升1的流速与氦气(质量5.0)一起转移到ICP-MS仪器中。使用ICP-MS仪器记录数据，仪器参数见表4。Igor Pro软件及其附加软件Iolite用于进一步处理数据和生成铂分布图。根据作者的手册，采用了"Trace_Elements"数据缩减方案，包括空白减去和不平滑可视化。


缺氧检测


用丙酮固定肿瘤切片，并按照Hypoxyprobet-1 Kit(hpi)方案进行染色。在共聚焦显微镜Leica CLSM中使用在PBST中稀释为1:1000的Alexa Flour 647标记的二抗进行荧光检测。由于细胞内聚力差，球体切片经不起固定，而且使用Hypoxyprobet-1试剂盒需要清洗步骤，因此按照之前的描述，用HIF-1 alpha抗体对整个球体进行染色。


缺氧室


在单层培养中进行缺氧诱导时，将细胞播种到96孔板中，让其附着24小时，然后在缺氧室中处理，通过氮气置换将氧气水平降至0.5%。细胞在氧气含量为0.5%的低氧室中处理96小时。


动物实验


6至8周大的雄性SCID小鼠饲养在无病原体环境中，所有操作均在层流气流柜中进行。在局部肿瘤生长实验中，将HT1080细胞(1×106个)皮下注射到动物右侧腹部。动物被随机分配到治疗组，当肿瘤结节达到B100 mm3时开始治疗。动物分别在第4、7、11和14天接受1号(静注8.3mg kg1，溶于5%DMSO)、2号(静注9.1mg kg1，溶于5%DMSO)或沙铂(静注10mg/kg，溶于5%DMSO)治疗。对照组动物腹腔注射水。每天检查动物是否出现不适症状，并通过卡尺测量定期评估肿瘤大小。肿瘤体积的计算公式为(长宽2)/2。


第15天，动物接受波硝唑(60毫克千克1毫升，溶于0.9%Na.溶于0.9%氯化钠)，30-60分钟后处死。为此，小鼠被麻醉并通过心脏穿刺采血。


氧气和氧化还原微电极测量


在用测量微电极时，用无菌过滤的PBS冲洗球体一次，然后用1PBS制备的1%琼脂糖重悬。将悬浮的球体等分到预热(37℃)的培养皿中，培养皿中含有1厘米厚的PBS-琼脂糖(1%)层。在循环水浴中进行微电极测量时，样品保持在37℃。


使用微电极(尖端直径10微米；Unisense)测量氧气和氧化还原电位曲线。微传感器的校准和测量按照制造商的说明，通过微传感器随附的软件界面(Unisense)进行。微传感器的校准使用测量前生成的两点标准曲线中的外部标准。


测量氧气时，在20摄氏度下对水进行剧烈曝气，以获得饱和氧气读数。通气5分钟后，停止鼓泡并记录重复测量值。根据溶液温度和盐度，使用微型传感器软件计算饱和氧气浓度。制备含0.1M NaOH中0.1M抗坏血酸钠的缺氧溶液，并进行重复测量。氧气分布的测量步长为20毫米，每步总测量时间为4秒。


氧化还原微传感器用pH值为4.0和7.0的标准喹氢酮饱和溶液(10克/L)进行校准。氧化还原测量使用银/氯化银参比电极进行。将微传感器固定在二维微剖面系统(Unisense)中，并使用SensorTrace Suite软件进行控制，从而收集深度剖面图。氧化还原测量的步长为30毫米，每个步长的总测量时间为14秒。