能量应激反应途径。


为了测试SDS细胞利用哪些代偿机制来抵消能量生产缺陷(能量应激)，我们评估了AMP激活蛋白激酶(AMPK)和PI3K/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)通路，它们是能量缺乏激活的主要调节机制。


在应激条件下，AMPK通过AMP积累被激活，拮抗mTOR并刺激糖酵解等替代性分解代谢过程，从而抵消能量限制。PI3K/AKT/mTOR通路通过线粒体和核糖体的生物生成诱导细胞增殖。被PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)在Thr803处磷酸化的AKT会抑制AMPK并诱导mTOR激活。因此，在野生型细胞中，当AMPK被激活时，PI3K/AKT/mTOR通路通常会受到抑制。

如预期的那样，在SDS细胞中，AMPK比对照组更活跃，如蛋白磷酸化形式的Western印迹分析所示(图3)。令人惊讶的是，我们发现与正常对照组和校正对照组相比，mTOR并未受到抑制，反而高度磷酸化。


与这一发现相一致的是，我们发现与野生型细胞和校正细胞相比，SDS细胞中AKT在Thr803和Ser473处也过度磷酸化，从而证实了整个PI3K/AKT/mTOR通路的过度激活。


总之，这些实验表明，SDS细胞对高能应激反应异常，而这种反应与SDS蛋白有关，因为在校正细胞中未见PI3K/AKT/mTOR通路超活化。


SDS细胞的细胞质钙浓度水平很高。


Ca2+调节真核蛋白质翻译和许多其他消耗ATP的细胞反应，因此是蛋白质合成和能量代谢的重要信号分子。此外，高[Ca2+]i与ROS细胞毒性、脂质过氧化和OXPHOS功能密切相关，并且会抑制复合体IV的活性。


在静息状态下，SDS细胞的[Ca2+]i比野生型细胞(65±2nM)或校正细胞(64±1nM)高出两倍(133±8nM)(表1)。


为了研究[Ca2+]i增高的原因，我们评估了ER从细胞质中捕获并储存钙的能力。事实上，ER是细胞内主要的钙储存场所，并通过SERCA(钙ATP酶通道)活性在Ca2+稳态中发挥重要作用，SERCA可将Ca2+从细胞质转移到ER。硫代碳酸氢盐(TG)不可逆地阻断SERCA通道，导致Ca2+从ER泄漏，从而增加[Ca2+]i。与SDS细胞相比，高剂量TG处理(3μM)会导致野生型细胞和校正细胞中的[Ca2+]i显著增加，从而表明这些细胞在ER中储存Ca2+的能力受损，这可能是[Ca2+]i增加的原因(表1)。


尽管我们没有发现任何SERCA通道活性差异，但我们推测[Ca2+]i的增加可能取决于我们在SDS细胞中观察到的mTOR激活，已知mTOR可通过肌醇-1,4,5三磷酸受体正向调节钙释放。


亮氨酸可恢复正常代谢表型。

由于亮氨酸(Leucine，Leu)是一种已知能促进蛋白质合成的必需氨基酸，即使在SBDS缺乏的细胞中也是如此，因此我们测试了亮氨酸在处理5天后对SDS淋巴细胞和淋巴母细胞的生化影响。经过Leu处理后，复合体IV的功能得到恢复，呼吸速率和ATP/AMP比率与对照组相当(图4A-D)，细胞内钙浓度也有所降低(图4G)。表型逆转还与脂质过氧化和乳酸产生的减少有关(图4E、F)。令人惊讶的是，用N-乙酰半胱氨酸(NAC)(一种抗氧化分子，是还原型谷胱甘肽的前体)处理后，在SDS细胞中观察到的呼吸缺陷、能量窘迫和钙平衡改变没有恢复或恢复较差。

然后，我们测试了Leu对SDS患者骨髓造血干细胞生长的影响，观察到红细胞集落生长适度增加，但髓系细胞集落生长没有增加(图5A)。由于Leu是mTOR激活的调节剂，我们研究了它在慢性SDS细胞处理后对能量应激途径的影响。不出所料，AMPK磷酸化的减少是正常OXPHOS恢复的结果。有趣的是，Leu处理后AKT和mTOR磷酸化水平也降低了(图5B)。可以推测这些影响是由于依赖于营养过剩的AKT/mTOR通路的反馈调节所致。说明Leu恢复了SDS细胞的生化表型，该分子可被视为恢复SDS细胞能量代谢的潜在工具。


讨论


SBDS蛋白在核糖体生物生成和蛋白质合成过程中发挥作用，而这两个高耗能过程与细胞能量的产生密切相关。细胞呼吸是将营养物质转化为生化能量(主要是ATP)的一系列代谢反应和过程。这一过程由一系列称为电子传递链的蛋白质复合物完成，电子传递链位于线粒体内膜，并与线粒体膜间隙和基质相连。呼吸功能受损会影响ATP的产生，并使细胞面临能量和氧化压力。


在本研究中，我们评估了SDS细胞的能量代谢，发现在丙酮酸/苹果酸或琥珀酸的诱导下，氧消耗会受损。因此，ATP生成减少，AMP积累，从而改变了ATP/AMP比率。


电子通过两条途径传输。第一种由复合物I、III和IV组成，从NADH中转移电子，可由丙酮酸/苹果酸诱导。另一种需要复合体II、III和IV，由琥珀酸激活，从FADH2中转移电子，能量产生效率低于第一种途径。由于丙酮酸/苹果酸和琥珀酸在SDS细胞中对耗氧量的影响程度相同，我们对两种途径共有的两个复合物(III和IV)的活性进行了研究，结果表明复合物IV不能正常工作。


复合体IV活性受损的原因尚不清楚。我们评估了分别由核基因和线粒体基因编码的复合体IV的两个亚基COX5A和COX2的表达水平，发现这两种蛋白的表达水平正常。这表明，尽管SDS细胞中存在核糖体生物发生和转导缺陷，但它们的合成并没有受损。不过，值得注意的是，复合体IV由32个蛋白质组成，其中3个由线粒体DNA编码，29个由核DNA编码。此外，其中11个是结构蛋白，18个是组装因子；因此，我们不能排除其他亚基表达较少或折叠不正确的可能性。


另一个原因可能是线粒体膜发生了变化，这是由复合体III和IV之间或复合体IV与氧之间的电子传递发生变化所决定的，从而导致细胞色素c氧化酶活性受损，氧化应激增加。然而，这种可能性似乎不大，因为我们在SDS细胞中测得的氧化应激水平较低，并观察到线粒体膜明显完整。


值得注意的是，尽管复合体IV在ROS生成中起间接作用，但复合体IV的损伤可能是由复合体I和复合体III的上游电子累积引起的，从而导致ROS生成增加。事实上，线粒体电子传递链包含多个氧化还原中心，可直接将电子传递给氧气，从而产生ROS。不过，也可能有其他结构参与了氧化应激诱导。特别是，由于SDS细胞的特点是蛋白质生物生成缺陷，缺陷蛋白质的积累可能会导致内质网中的未折叠蛋白反应。


复合体IV受损的另一个可能原因与所报道的SDS细胞中钙水平的改变有关。细胞内的钙平衡在调控生化通路中发挥着重要作用，而生化通路可调节对高能应激的反应。特别是，Ca2+对能量代谢有双重影响。一种作用是，[Ca2+]i可增强OXPHOS，从而激活克雷布斯循环脱氢酶和线粒体底物转运体。另一个作用是，[Ca2+]i可能通过竞争复合体IV的阳离子结合位点而影响其活性。

考虑到这些数据(图6)，在SDS细胞中观察到的高[Ca2+]i可能与解释SDS细胞的生化表型有关。SBDS与类延伸因子1(EFL1)合作，使eIF6从前60S核糖体亚基中释放，从而形成核糖体80S。因此，在SDS细胞中，60S亚基的成熟是有缺陷的，其与40S亚基的结合也受到损害。此外，即使在细胞质中，eIF6与前60S亚基的结合也会持续存在，阻止其循环到核仁。考虑到eIF6的核导入受细胞内Ca2+的调节，我们可以推测，SDS细胞中细胞质钙浓度的增加试图平衡核糖体生物发生的缺陷。


能量应激会诱导细胞新陈代谢发生变化，从而刺激或抑制参与能量平衡调节的分子网络，如AMPK和mTOR。在观察到的SDS细胞中，由于能量应激，AMPK被过度激活，糖酵解途径受到刺激。令人惊讶的是，我们还发现AKT/mTOR通路被异常地过度激活，因为这两种蛋白都被过度磷酸化。我们推测，mTOR过度激活是SDS细胞支持能量缺陷和蛋白质合成的一种方式，目的是改善OXPHOS活性。然而，用mTOR拮抗剂雷帕霉素处理SDS细胞可完全抑制残余的OXPHOS活性，从而减少ROS的产生，进而通过糖酵解恢复能量。这表明，在SDS细胞生化改变的过程中，OXPHOS活性的增加在保证ATP产量增加的同时，也可能导致氧化应激的增强和细胞损伤的潜在增加(图6)。在AMPK激活的情况下，mTOR激活的另一个潜在机制可能与自噬激活有关。在核糖体病中，氧化应激的增加会通过mTOR-S6激酶途径诱导自噬。考虑到本手稿中报告的数据，我们可以假设AMPK活性增强可能与细胞能量状态受损有关，而mTOR通路激活可能与氧化应激产生水平较高有关。


此外，mTOR还控制着几个依赖Ca2+的过程。例如，它正向调节IP3R(三磷酸肌醇受体)介导的Ca2+释放，并与Akt共同参与调节线粒体相关内质网膜(MAM)的完整性、钙通量和能量代谢。


最后，糖酵解代谢的增加会引起乳酸的积累和细胞内pH值的降低，从而导致钙泵受到抑制，细胞膜[Ca2+]随之增加(图6)。


亮氨酸是一种必需氨基酸，能促进细胞增殖和蛋白质合成。核糖体病或其他核糖体生物发生缺陷的病症可从这种氨基酸的治疗中获益。与这些研究一致，我们发现亮氨酸能改善SDS患者的体外红细胞生成。此外，用亮氨酸处理SDS细胞可恢复OXPHOS和ATP合成，降低细胞质钙浓度以及AMPK和AKT/mTOR活性，这表明亮氨酸可能有助于维持SDS患者紊乱的能量代谢和红细胞生成。特别是，考虑到亮氨酸能提高OXPHOS活性，部分恢复呼吸作用，因此它可能是AMPK和AKT/mTOR通路的调节剂，能恢复它们的生理作用。我们可以推测，亮氨酸诱导的氧化应激减少会导致mTOR-S6激酶途径失活。


最后，值得注意的是，能量代谢是维持自我更新干细胞的决定因素。骨髓中的造血干细胞被封闭在缺氧的微环境中。缺氧条件使造血干细胞处于静止状态，这与糖酵解代谢有关。在(不对称)自我更新干细胞分裂过程中，一个细胞保持干细胞的糖代谢特征，而另一个细胞则进入血管，获得OXPHOS代谢并进行分化。造血干细胞对氧化应激增加很敏感，而线粒体氧化磷酸化是产生ROS的主要原因。因此，糖酵解代谢是造血干细胞自我更新维持的决定因素。为了减少线粒体代谢，造血干细胞会积极调节AMPK，同时抑制PI3K/mTOR通路。AKT或mTOR信号的持续活跃和高[Ca2+]i水平会导致增殖增加和造血干细胞贫化。因此，这项研究可为了解导致SDS患者骨髓衰竭的生化途径提供一个新的视角。


总之，我们首次发现，尽管SDS细胞的线粒体形态没有发生显著变化，但它却遭受着与SBSD蛋白缺陷有关的能量应激和严重的呼吸缺陷。这些缺陷可通过增强的AMPK、糖酵解和mTOR/Akt通路激活得到部分补偿。在维持这种改变的新陈代谢中起关键作用的可能是钙平衡的改变。