耗氧量测量


在37°C的密闭室中使用安培电极(Unisense)测量耗氧量。2×105个细胞用0.03毫克/毫升的洋地黄皂苷进行透化处理。测量在含有137 mM NaCl、5 mM KCl、0.7 mM K2 HPO4和25 mM Tris-HCl pH 7.4的培养基中进行。加入10 mM丙酮酸和5 mM苹果酸，以刺激由复合物I、III和IV组成的通路。加入20毫摩尔琥珀酸以刺激由复合物II、III和IV形成的途径。0.1 mM的鱼藤酮或50µM的抗霉素A(复合物I或复合物III的特异性抑制剂)分别用于阻断第一条和第二条途径。


生物发光荧光素酶ATP测定


为了评估通过Fo-F1 ATP合成酶合成ATP的情况，将2×105个细胞在37°C培养基中培养10分钟，培养基中含有：10 mM Tris-HCl(pH 7.4)、100 mM KCl、5 mM KH2PO4、1 mM EGTA、2.5 mM EDTA和5 mM MgCl2、0.6 mM ouabain和25 mg/ml氨苄青霉素。然后，加入10毫摩尔丙酮酸加5毫摩尔苹果酸或20毫摩尔琥珀酸，分别刺激由复合物I、III和IV或复合物II、III和IV组成的通路，诱导ATP合成。使用10-8和10-5 M之间的ATP标准溶液，通过荧光素/荧光素酶化学发光法(试剂盒)，在荧光计中每隔30秒监测反应两分钟。数据以nmol ATP生成/分钟/106个细胞表示。


ATP和AMP水平的评估


根据酶偶联法，在340纳米波长处进行NAD(P)/NAD(P)H还原/氧化后，测量ATP和AMP。ATP定量测定在含有以下成分的培养基中进行：100 mM Tris-HCl，pH 7.4，5 mM MgCl2，50 mM葡萄糖，0.2 mM NADP。加入4µg纯化的己糖激酶和2µg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶后开始检测。


使用以下培养基检测AMP浓度：100 mM Tris-HCl，pH 7.4，5 mM MgCl2，10 mM磷酸烯醇丙酮酸，0.15 mM NADH，0.2 mM ATP。在加入4µg纯化丙酮酸激酶加乳酸脱氢酶和2µg腺苷酸激酶后，开始进行测定。


乳酸释放的评估


在NAD+还原后，测量生长培养基中的乳酸浓度。测定混合物包括100mM Tris-HCl pH 7.4、5mM NAD+和4IU乳酸脱氢酶。数据以细胞数为标准。


线粒体膜电位的评估


为了评估不同肿瘤细胞系的线粒体膜电位，在生长培养基中加入250 nM的Mitotracker 633(MT633)，在平板读取器中每10分钟监测一次荧光，持续60分钟，分别使用644 nM和665 nM作为激发波长和发射波长。


糖酵解酶测定


酶活性以IU/mg(微摩尔/分钟/mg蛋白质)表示。测定以50µg总蛋白为基础。用于测定每种酶活性的反应混合物的制备方法如下。己糖激酶(HK，EC 2.7.1.1)：100 mM Tris-HCl pH 7.4、5 mM MgCl2、200 mM葡萄糖、1 mM ATP、0.91 mM NADP和0.55 IU/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)。磷酸果糖激酶(PFK，EC 2.7.1.11)：100 mM Tris-HCl pH 7.4、2 mM MgCl2、5 mM KCl、2 mM 6磷酸果糖、1 mM ATP、0.5 mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、0.2 mM NADH和2 IU/ml丙酮酸激酶加乳酸脱氢酶。丙酮酸激酶(PK，EC 2.7.1.40)：100 mM Tris-HCl pH 7.6、2.5 mM MgCl2、10 mM KCl、0.6 mM磷酸烯醇丙酮酸、0.2 mM NADH、5 mM ADP和1 IU/ml乳酸脱氢酶。乳酸脱氢酶(LDH，EC 1.1.1.27)：100 mM Tris-HCl pH 9、5 mM丙酮酸和0.2 mM NADH。


过氧化氢酶活性测定


消耗5mM H2O2后，用分光光度法评估50µg总蛋白质的过氧化氢酶活性。酶活性以IU/mg(微摩尔/分钟/mg蛋白质)表示。


丙二醛的评估


为了评估脂质过氧化，使用硫代巴比妥酸活性物质(TBARS)测定法评估丙二醛(MDA)浓度。TBARS溶液包含15%三氯乙酸(TCA)和0.25 N HCl以及26mM硫代巴比妥酸。


为了评估MDA的基础浓度，将600µl的TBARS溶液加入溶解在300µl毫升水的50µg总蛋白质中。混合液在100°C下培养40分钟。然后，样品在14,000 rpm转速下离心2分钟，上清液在532纳米波长下进行分光光度分析。


Western blot分析


蛋白质裂解物的制备方法如前所述。蛋白质裂解液在十二烷基硫酸钠-10%或14%聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后用兔mAb抗磷酸-AMPKα(Thr172)(克隆40H9)、兔mAb抗LAMP1(克隆C54H11)和过氧化物酶结合的山羊抗兔抗体作为二抗进行培养。根据制造商的说明，使用增强化学发光系统对免疫复合物进行显色。


小鼠体内治疗研究


在六周大的雌性裸鼠右腹部皮下注射1×105个B16小鼠黑色素瘤肿瘤细胞。小鼠被随机分配接受每公斤体重30毫克的姜黄素或仅接受载体(对照组小鼠)。当小鼠可触及肿瘤(肿瘤直径约2毫米)时，将溶解的姜黄素或单独的载体注射到小鼠尾静脉，连续十天。肿瘤体积用卡尺测量，计算公式如下：肿瘤体积(立方毫米)=(长×宽×高，单位：毫米)×π/6。每天记录小鼠的体重和一般身体状况，当小鼠出现健康状况不良的迹象时，用甲苯噻嗪麻醉后颈椎脱臼处死。


免疫荧光分析及微血管密度和血管大小的量化


治疗结束后对皮下肿瘤进行组织学评估。简而言之，将肿瘤样本固定在10%的缓冲福尔马林溶液中，并用石蜡包埋。为了进行免疫荧光分析，从石蜡块上切下4微米厚的切片，用识别内皮细胞的单克隆抗体染色，即抗CD34和α平滑肌肌动蛋白。然后用FITC结合的山羊抗兔和抗鼠(Abcam)二抗培养载玻片。所有抗体染色实验均使用同型匹配的非结合mAbs，以排除非特异性反应。用磷酸盐缓冲生理盐水清洗玻片后，用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行反染色，然后盖上玻片。使用尼康E-1000荧光显微镜和Genikon成像系统软件采集数字图像。从两个独立实验中随机抽取15个视野，量化CD34和αSMA阳性细胞的百分比。


结果


姜黄素通过抑制ATP合成酶的活性，降低体外和体内ATP的生成和耗氧量，从而诱发致命的能量损伤


鉴于之前有迹象表明姜黄素能抑制原核生物ATP合成酶的活性，我们研究了这种多酚对来自不同组织的一系列小鼠癌细胞的影响。我们通过荧光测定法分析了小鼠B16黑色素瘤、CT26结肠癌、4T1乳腺癌细胞和L1210淋巴细胞白血病细胞分离的线粒体膜中ATP合成酶的活性。我们观察到所有细胞系的ATP合成酶活性都明显降低。在B16、CT26、L1210和4T1细胞中，ATP合成酶活性分别降低了46%、36%、64%和30%(图1A)。在B16、CT26、L1210和4T1细胞中，ATP合成酶活性的抑制与ATP生成量分别减少32%、18%、35%和46%有关。除CT26以外，其他细胞系ATP生成量显著减少(图1B)。


在B16、CT26、L1210和4T1细胞中，ATP/AMP比值(细胞整体能量电荷的综合指标)分别显著降低了23%、61%、21%和36%(图1C)。由于抑制了ATP合成酶，姜黄素在所有细胞系中都导致质子积累引起膜电位显著升高(补充图1)。


在丙酮酸/苹果酸(图1D)和琥珀酸(图1E)存在的情况下，用氧微量呼吸电极测量，细胞的耗氧量也随之急剧下降。

我们还测试了姜黄素对ATP合成的影响是否可以通过抑制NFκB来模拟。为此，我们使用了IkKβ特异性竞争抑制剂SC-514，因为有报道称姜黄素可作用于该激酶。图1F显示，联合添加SC-514和姜黄素4小时和24小时后，SC-514对B16细胞的ATP合成没有影响。与之前观察到的一样，与姜黄素同时处理的B16细胞ATP合成减少(图1F)。与单用姜黄素处理的细胞相比，SC-514与姜黄素的组合没有产生任何叠加效应(图1F)。不过，姜黄素和SC-514都能显著抑制Bcl2的表达，Bcl2是一种抗凋亡基因，其转录受NFκB控制，但两者的动力学过程显然不同(图1G)。姜黄素和SC-514的组合没有显示出任何相加效应。这些数据表明，姜黄素对NFκB和ATP合酶都有抑制作用，但对后者的活性并不取决于对前者的活性。

我们研究了在体内是否可以观察到的所有四种细胞系对ATP合酶活性的抑制。我们在免疫缺陷小鼠皮下注射B16小鼠黑色素瘤细胞。当可触及肿瘤(肿瘤直径约2 mm)时，每隔一天向尾静脉注射溶解的姜黄素(30 mg/kg)或单独的姜黄素，连续10天，用卡尺测量肿瘤体积。姜黄素处理小鼠的肿瘤生长明显低于对照处理小鼠(图2A)。实验结束时，切除肿瘤，制备线粒体膜组分，分析ATP合成及ATP和AMP含量。与对照组小鼠相比，姜黄素处理动物肿瘤中ATP合酶活性、ATP浓度和ATP/AMP比值显著降低(图2B)，表明姜黄素在体内也能抑制ATP合酶。