据报道，姜黄素主要通过抑制炎症的主要调节因子--核因子κB(NFκB)来降低细胞生长和诱导细胞凋亡，从而抑制炎症、肿瘤生长、血管生成和转移。最近的报道还表明，姜黄素具有潜在的代谢效应，因此我们分析了姜黄素是否以及如何影响肿瘤细胞的能量代谢。我们的研究表明，姜黄素(10µM)可抑制离体线粒体膜中ATP合酶的活性，导致ATP急剧下降，并减少体外和体内肿瘤模型的耗氧量。姜黄素对ATP合成酶的影响与抑制NFκB无关，因为IκB激酶抑制剂SC-514不会影响ATP合成酶。糖酵解酶己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的活性只受到细胞类型特异性的轻微影响。能量受损会导致肿瘤细胞活力下降。此外，姜黄素通过促进活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)(脂质氧化的标志物)的生成以及自噬诱导细胞凋亡，至少部分原因是激活了AMP激活蛋白激酶(AMPK)。根据体外抗肿瘤效果，姜黄素(30毫克/千克体重)可显著延缓体内癌症的生长，这可能是由于能量受损，也可能是通过减少肿瘤血管生成。这些结果证明，细胞能量代谢的核心酶ATP合酶是抗肿瘤多酚的靶点，它能抑制癌细胞生长，并全面重塑肿瘤代谢。


引言


姜黄素(diferuloylmethane；(1E,6E)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮)是从姜科植物姜黄中分离出来的一种多酚。它被用作香料，是咖喱的基本黄色成分。近年来，尽管姜黄素生物利用度低、吸收差、新陈代谢快、全身消除快，而且姜黄素治疗患者的血液中检测到的姜黄素含量很低，但许多研究都报告了姜黄素的抗肿瘤活性，甚至通过饮食给药治疗实体癌。据报道，姜黄素及其衍生物和类似物可通过影响多种细胞信号传导途径发挥作用，但这种多酚的主要活性是抑制IκB激酶(IkK)，使核因子κB抑制剂(IκB)稳定在去磷酸化状态，并以非活性形式将NFκB封闭在细胞质中。最近的研究还揭示了它作为新陈代谢调节剂的潜力，这种活性与减少炎症和抑制NFκB有关。然而，人们很少关注姜黄素和其他多酚对癌细胞能量代谢的最终影响。


肿瘤的生长需要增加核苷酸、氨基酸和脂质等细胞构件的合成。因此，肿瘤细胞的新陈代谢具有增殖细胞的典型特征，必须满足三个新陈代谢需求：(i)生物能，(ii)大分子生物合成和(iii)氧化还原维持。因此，癌细胞新陈代谢的特点是对葡萄糖的摄取量增加，而葡萄糖通过有氧糖酵解(沃伯格效应)优先代谢为乳酸，尽管与氧化磷酸化相比，这一过程产生ATP的效率较低。然而，由于葡萄糖优先分解为乳酸，肿瘤细胞可将各种糖酵解中间产物分流到支持增殖的合成代谢途径中。短期饥饿和禁食模拟饮食可以逆转肿瘤细胞的沃伯格效应，导致其凋亡，使肿瘤细胞对化疗敏感，并增强抗肿瘤免疫监视，从而保护正常细胞功能。有趣的是，姜黄素和绿茶提取物表没食子儿茶素-3-棓酸盐等多酚类物质似乎也能触发通常由长期热量限制或短期饥饿引起的分子通路。因此，如果姜黄素有可能模拟禁食的这些作用，那么它有望对肿瘤代谢产生重大影响。虽然尚未进行系统的临床研究，但多酚类化合物抵制代谢综合征发展的潜力已经得到证实。


姜黄素通过诱导AMP激活激酶(AMPK)降低血糖水平，并阻断肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的乳腺癌细胞糖酵解。后一种作用是通过姜黄素的抗炎和抗NFκB活性发挥的。Bayet-Robert及其同事对姜黄素处理过的乳腺癌细胞进行了代谢组学研究，发现谷胱甘肽和脂质代谢以及葡萄糖利用是多酚的主要作用靶点。谷胱甘肽的生物合成随着姜黄素诱导的活性氧(ROS)的增加而上调。对脂质代谢的活性可能与化合物对NFκB通路的影响有关。姜黄素和其他多酚可能通过产生ROS来影响线粒体的功能，但人们很少关注这些化合物对线粒体能量代谢的影响。包括姜黄素在内的几种多酚对正常组织线粒体ATP合成酶活性的抑制作用已被证实，但其效果取决于组织。姜黄素对细菌ATP合成酶的抑制遵循一种独特的机制，涉及F1分子的旋转周期。因此，姜黄素极有可能对真核生物ATP合酶产生类似作用，对细胞能量代谢产生重大影响。


我们通过分析姜黄素对癌细胞能量代谢的影响来解决这一问题。我们发现姜黄素能抑制ATP合成酶的活性，从而影响ATP/AMP比率和耗氧量，进而导致细胞活力降低、ROS生成增加、细胞凋亡和自噬。姜黄素对ATP合成酶的抑制作用在体内持续存在，并伴随着肿瘤血管生成的减少，从而导致肿瘤生长的降低。姜黄素对ATP合成酶的影响与NFκB无关。


材料与方法


化学物质


姜黄素溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，最终浓度为100 mM，在使用前储存在-20°C下。在体外实验中，使用前立即将其稀释在完全培养基中。活性浓度是在B16细胞的初步体外实验中确定的。在体内实验中，按照Pisano等人描述的方案，将剂量提高到30毫克/千克体重。姜黄素被稀释在含1.65毫克/毫升牛血清白蛋白的无菌0.9%(w/v)氯化钠溶液中。姜黄素稀释液在注射前立即新鲜配制并避光保存。


细胞系和培养条件


L1210小鼠淋巴细胞白血病、4T1小鼠乳腺癌、B16小鼠黑色素瘤和CT26小鼠结肠肿瘤细胞系于2016年3月16日购自ATCC，并在意大利细胞系中心通过微卫星分析进行了鉴定。所有肿瘤细胞系均在添加了1%L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素和10%胎牛血清(完全培养基)的DMEM培养基中培养。


细胞活力、凋亡和自噬的评估


在完全培养基中将肿瘤细胞株培养在12孔板中(CT26和4T1每孔1×105个，B16每孔3×104个，L1210每孔2×105个)。24小时后，用10µM的姜黄素处理细胞24小时，然后收获细胞并用台盼蓝排除法评估细胞数量。在某些实验中，细胞与10µM的特异性IKKβ抑制剂SC-514和姜黄素共同培养4小时和24小时。用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒评估细胞凋亡。为了进行自噬分析，用Lipofectamine 2000转染了750ng pEX-HcRed-hLC3WT质粒(编码与HcRed荧光蛋白融合的LC3B蛋白)的B16黑色素瘤细胞。72小时后，用MetOH/丙酮1:1的比例固定所有不同处理的样本，用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤，然后用Prolong Gold Antifade试剂固定，并用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)反染色以鉴定细胞核。


采用荧光显微镜对LC3B点进行定量，使用尼康相机和ACT-2U图像软件获取图像。每个实验重复两次，分析至少50个转染细胞。使用100倍倍率物镜获取图像。


ROS生成分析


将肿瘤细胞播种到12孔板中，并按上述方法处理。细胞用1µM氧化敏感染料2ʹ,7ʹ二氯荧光素二乙酸酯在磷酸盐缓冲盐水中染色，37°C 30分钟，然后用FACS Calibur或Gallios细胞仪和CellQuest或Kaluza软件分析样本。