结果

根际沉积物理化指标

N2近根际子隔室中的NO₃-N浓度最高（1.46±1.66 mg l⁻¹），根区和非根际区最低（分别为0.30±0.14和0.39±0.16 mg l⁻¹）（F=3.611, P=0.003）（表1）。NH₄-N浓度（10.61±7.80 至 13.28±9.49 mg l⁻¹）（F=0.169, P=0.984）和pH（7.56±0.23 至 7.62±0.14）（F=0.151, P=0.962）在各根箱隔室之间无显著变化。氧渗透深度（Dop）在各隔室间从14.4±6.6降至10.6±4.5 mm，但这并不显著（F=1.136, P=0.349）。

表1 沉水植物菹草根际和非根际沉积物及孔隙水的理化性质。数值为平均值（标准差）；n=12。

注：R和Non分别代表根区隔室和非根际区隔室的沉积物样品。N1-N5代表取自近根际区1至5毫米子隔室的沉积物样品。

- 表示根系阻碍了根区隔室内的微电极测量。

- 表示未测量非根际区。

同一列数值后不同字母表示存在显著差异（P < 0.05）。

类产氧甲烷杆菌16S rRNA基因多样性

本研究共获得324条NC10门细菌序列（表2）。所有序列根据97%相似性划分为16个OTUs。每个根箱夹层检测到约45-50条序列，代表4到6个不同的OTUs（表2）。在N1近根际子隔室中发现了最多的OTUs（6个），而在根区（R）和N5近根际子隔室中发现了最少的OTUs（各4个）。文库覆盖率值在0.94至1.00之间，表明菹草根际沉积物中的类产氧甲烷杆菌16S rRNA基因序列在这些克隆文库中已充分代表。N2近根际子隔室具有最高的多样性，香农指数和Chao1丰富度估计量分别为1.16和5。在N3近根际子隔室观察到最低的多样性，香农指数和Chao1丰富度估计量分别为0.73和6。

表2 沉水植物菹草根际和非根际沉积物中类产氧甲烷杆菌的多样性指数。

注：R和Non分别代表根区和非根际区隔室的沉积物样品；N1-N5代表取自近根际区1至5毫米子隔室的沉积物样品。

类产氧甲烷杆菌16S rRNA基因的系统发育多样性

根据Ettwig et al.（2009），OTU1-11的代表性序列被归类到b群，与产氧甲烷杆菌16S rRNA基因的相似性为88-93%（表3）。b群序列被分类到指定的1至5簇。OTU12代表NC10细菌的一个新簇，不属于a, b, c或d组（图2）。

簇1中的序列与非根际隔室的产氧甲烷杆菌16S rRNA基因有92%的相似性。簇2包含OTU2、OTU8、OTU10、OTU11和OTU15。该簇包含来自除N5子隔室（N5）之外所有夹层的73条序列，与产氧甲烷杆菌的相似性为90-92%。簇3是b群中的优势簇，包含序列数最多（总共324条序列中的205条）。簇3成员在所有夹层均有记录，与产氧甲烷杆菌的相似性为91-92%。簇4与产氧甲烷杆菌的相似性最高（93%），包含除根区隔室（R）外所有夹层的42条序列。簇5和OTU12在N1和N3近根际子隔室中检测到，与产氧甲烷杆菌的序列相似性为88-89%（表3）。

表3 沉水植物菹草根际和非根际沉积物中类产氧甲烷杆菌16S rRNA基因的分布和相似性。

注：R和Non分别代表根区和非根际区隔室的沉积物样品；N1-N5代表取自近根际区1至5毫米子隔室的沉积物样品。

讨论

在本研究中，我们使用根箱法调查了常见沉水植物根际和非根际区域类产氧甲烷杆菌的出现和多样性。结果表明，这些细菌存在于根际和非根际沉积物中。大多数OTUs被归类到b群。每个根箱夹层有4到6个OTUs。细菌群落多样性指数（香农指数）和丰富度指数（Chao1）分别为0.73-1.16和4-9。

各隔室的多样性排序为：近根际区 > 根区 > 非根际区（表2），表明近根际区更有利于类产氧甲烷杆菌群落。一些研究发现反硝化细菌（Ruiz-Rueda, Hallin & Bañeras, 2009），包括厌氧氨氧化细菌（Li et al., 2016）和厌氧甲烷氧化细菌（Vaksmaa et al., 2016）分布在沉水水生植物根系周围。在我们的研究中，根区和近根际区都具有较高的类产氧甲烷杆菌多样性，这可能是由于植物根部周围甲烷和亚硝酸盐浓度增加所致。植物根系分泌物和植物残体提供的有机质（OM）可被产甲烷古菌转化为甲烷（CH₄）（Kerdchoechuen, 2005）。此外，根际中的部分反硝化和硝化作用都可能产生亚硝酸盐（Nie et al., 2015）。这些底物有利于类产氧甲烷杆菌在近根际沉积物中的生长。

本研究七个夹层中获得的序列与从其他水生生态系统回收的类产氧甲烷杆菌16S rRNA基因序列具有高度相似性。本研究中的簇与河口沉积物（Yan et al., 2015）、湿地（Wang et al., 2012, 2016; Hu et al., 2014）、湖泊（Wang et al., 2015, 2017; Kojima et al., 2012）和厌氧污水污泥（Ma et al., 2017）中的序列密切相关。b群序列主导了菹草根际和非根际区域的类产氧甲烷杆菌（图2）。本研究未扩增出功能基因pmoA。同样，在中国东昌湖和东平湖的沉积物中也只发现了类产氧甲烷杆菌16S rRNA基因的b群序列（Wang et al., 2017）。在三峡水库沉积物中，大多数序列（65/67）属于b群（Wang et al., 2016），类似地在琵琶湖沉积物（5/6 OTUs属于b群）（Kojima et al., 2012）和一个城市湿地（8/11 OTUs属于b群）（Shen et al., 2015）中也观察到。相反，在椒江口沉积物中，超过87%的类产氧甲烷杆菌16S rRNA基因序列被归类为a群（Shen et al., 2014b）。没有证据表明主要由b群细菌组成的群落可以在没有a群的情况下主导N-DAMO，并且这两者在大多数自然环境中似乎是共存的。需要进一步研究b群的功能，以增进我们对根际NC10细菌群落的理解。

本研究中类产氧甲烷杆菌的多样性指数与来自河流（Shen et al., 2014a）和湿地（Wang et al., 2016）的其他淡水沉积物相似。然而，在自然环境中，海洋和河口沉积物中通常发现比淡水沉积物（来自河流和湿地（Yan et al., 2015; Shen et al., 2014a; Wang et al., 2016），特别是湖泊（Deutzmann & Schink, 2011; Kojima et al., 2012; Wang et al., 2017））更高的类产氧甲烷杆菌多样性。最近，一项关于类产氧甲烷杆菌分布模式的全球分析表明，海洋和淡水生境之间存在显著的群落差异（Zhang, Liu & Gu, 2018）。因此，群落差异可能是该细菌在海洋中多样性高于淡水的主要原因。

在本实验中，同一夹层的样品被混合后进行测序。虽然混合法能够检测到所有的类产氧甲烷杆菌，但该方法无法统计分析不同夹层间OTUs的显著差异。因此，本文未分析该细菌的空间分布。

结论

在菹草所有三个隔室的沉积物中都检测到了类产氧甲烷杆菌16S rRNA基因。根际OTU较少，每个夹层仅存在4到6个OTUs。香农指数和Chao1指数与淡水湿地和河流沉积物中的相似。系统发育分析表明，除一个OTU属于NC10细菌的新簇外，所有OTU均被归类为类产氧甲烷杆菌16S rRNA基因的b群，这表明b群细菌可能在氮生物地球化学循环中很重要，并可能在调节淡水系统富营养化中发挥重要作用。