材料与方法

测试沉积物和植物

沉积物样品采自中国湖北省梁子湖（114°38'23"N, 30°14'28"E）。沉积物基本特征为：含水量72.5±1.3%，有机质（OM）8.85±0.86 g kg⁻¹，总氮0.50±0.06 g kg⁻¹，总磷0.45±0.05 g kg⁻¹。孔隙水的化学组成为：铵态氮（NH₄-N）4.39±1.29 mg l⁻¹，硝态氮（NO₃-N）0.22±0.07 mg l⁻¹，pH 6.99±0.08。选择菹草（Potamogeton crispus, Potmogetonaceae），一种常见的多年生草本沉水植物，作为本实验的寄主植物。这种植物也是中国南方湖泊的本地种。

根箱设计

使用具有多层隔室的三隔室根箱培养菹草。根箱根据He et al.（2005）的设计进行了修改（图1）。每株植物在培养期间完全浸入水箱（高度350毫米）底部。使用风干沉积物填充三个隔室。根箱包含三个部分：根区隔室（宽度20毫米）、近根际区隔室（5毫米）和非根际区隔室（>5毫米）。近根际区隔室通过尼龙网（<25μm）进一步分成五个子隔室（厚度1毫米），以防止根毛进入相邻的沉积物夹层，并保持沉积物夹层中的微生物和根系分泌物分离。

植物培养与样品采集

选择六颗具有相似萌发时间和生长特性的菹草鳞茎种植在根区隔室。植物从2014年11月至2015年5月培养6个月。为了模拟淡水湖泊的低、中、富营养三种营养状况，使用了缓释尿素（鲁西化工有限公司，聊城，山东，中国）作为营养输入，浓度分别为0、400和600毫克尿素每千克沉积物。每个营养浓度实验包含三个重复根箱。培养5个月后，植物根系填满根区隔室，将缓释尿素注入沉积物。在尿素注入后第0天开始，每隔14天采集样品，持续56天，采集根区（R）、五个近根际区子隔室（N1-N5）和非根际区隔室（Non）的沉积物样品（每种营养条件下三个平行样品）。来自同一夹层的沉积物样品混合，然后使用七个混合样品进行DNA提取、克隆和测序，以检测每个夹层是否存在类产氧甲烷杆菌。

理化指标测定和基因组DNA提取

在收集沉积物之前，使用微电极系统（Unisense, Aarhus, Denmark）原位测量根际沉积物的溶解氧（DO）和pH。由于微电极系统探针长度有限，测量深度为48毫米。根据测量的DO值确定每个近根际子隔室的氧渗透深度（Dop, DO > 6.25 μmol l⁻¹）。收集的沉积物在4,000 rpm下离心10分钟以获得孔隙水。使用流动注射分析（SEAL Analytical AA3; SEAL Analytical, Norderstedt, Germany）测定孔隙水中NH₄-N和NO₃-N的浓度。

使用土壤快速DNA提取试剂盒（Fast DNA Spin Kit for Soil, MP Biomedicals, Fountain Parkway Solon, OH, USA）按照制造商的说明提取沉积物的基因组DNA。每次DNA分离使用约0.5克沉积物。提取的DNA随后储存在-20°C直至进一步分析。使用NanoDrop 2000紫外-可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）测定DNA浓度，并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检查质量。

扩增、克隆和测序

采用巢式PCR扩增类产氧甲烷杆菌的16S rRNA基因。第一步使用引物202F (5'-GACCAAAGGGGGCGAGCG-3') (Ettwig et al., 2009) 和1545R (5'-CAKAAAGGAGGTGATCC-3') (Juretschko et al., 1998)，第二步使用针对NC10细菌的特异性引物qP1F (5'-GGGCTTGACATCCCACGAACCTG-3') 和 qP2R (5'-CGCCTTCCTCCAGCTTGACGC-3') (Ettwig et al., 2009)。反应体系为：12.5 μl 2× High-Fidelity Master Mix (blue), 1 μl 正向引物 (10 μM), 1 μl 反向引物 (10 μM), 1 μl DNA模板 (20-50 ng μl⁻¹), 和 9.5 μl ddH₂O。PCR条件为：98°C预变性5分钟；然后98°C变性10秒、56°C退火10秒、72°C延伸20秒，共35个循环；最后72°C延伸5分钟。使用pClone 007载体连接试剂盒（TSING KE, 北京, 中国）对PCR产物进行克隆。从每个夹层随机挑选约50个阳性克隆进行测序以构建克隆文库。

统计分析

使用方差分析（最小显著性差异法（LSD）和Tukey检验）检测沉积物和孔隙水理化指标之间的显著差异。应用3%的操作分类单元（OTU）截断值来确定类产氧甲烷杆菌16S rRNA基因的遗传多样性，并使用Mothur程序（v.1.34.4）（Schloss et al., 2009）中的最远邻法（furthest neighbor method）进行序列聚类。使用ClustalW 1.6程序进行多序列比对。使用Mega 6软件，采用邻接法（neighbor-joining method）进行16S rRNA基因序列的系统发育分析。计算模型为Jukes-Cantor模型。使用1000次重复的Bootstrap分析来检验树状图聚类的置信水平（Shen et al., 2014a）。使用Mothur软件（v.1.34.4）生成Chao1估计量和香农指数以评估多样性。本研究获得的序列在NCBI数据库中与产氧甲烷杆菌序列（FP565575）进行BLAST以获取相似性，并在GenBank中上传，登录号为MH092300-MH092623。