讨论

这项实验研究提供了新的数据，支持这样一种观点，即模仿OSA的慢性间歇性缺氧模式实际上会降低男性的生育能力。有趣的是，我们发现精子活力的改变甚至发生在预期较低的实验系列中。这是在精子质量不受老化影响的最年幼的小鼠身上发现的，这些小鼠只接受了30天的间歇性缺氧，略低于小鼠精子发生的约40天持续时间。此外，最重要的结果是，在更真实地模拟OSA患者临床状况的动物身上观察到的后代减少情况：中年小鼠受到长时间、慢性、间歇性缺氧的影响。

以往有关低氧对精子质量影响的实验研究是在持续低氧条件下进行的或在动物交替处于常氧和低氧状态下进行的，每次持续数天，以模拟对低海拔和高海拔的周期性适应过程。这些研究报告了空气中低氧浓度引起的睾丸/精子氧化应激和其他组织学/解剖学改变。然而，在恒定或极低频交替缺氧条件下获得的数据并未提供有关OSA所特有的高频间歇性缺氧对男性生育能力潜在影响的信息。因此，本研究的实验方法专门针对这一目的。事实上，对小鼠施加的缺氧呼吸模式相当严重，但绝非例外，与实验性OSA研究中采用的典型缺氧范式类似。此外，为了更好地描述整个过程，我们研究了病理生理级联过程中不同层次的变量。首先，我们发现间歇性缺氧实际上转化为睾丸组织中高频率的缺氧/复氧事件(图1)。其次，通过传统的生物标记物评估了睾丸的相关氧化应激(图2)。第三，我们发现精子随后会逐渐丧失活力(图3)。最后，通过交配试验证明了男性生育能力的实际下降(图4)。

睾丸局部缺氧/复氧事件是间歇性低氧供血的直接后果，应被视为随后观察到的精子变化的主要原因。睾丸PtO2是通过电化学微电极测量的，该微电极具有极佳的分辨率：观察到的样本面积小，时间响应快(直径50μm，90%响应时间<2秒)。事实上，这种工具以前曾用于测量OSA啮齿动物模型中其他组织(大脑、肌肉、脂肪、肝脏)的PtO2。有趣的是，我们在小鼠睾丸中获得的约12mmHg基线值与之前在大鼠、兔子、绵羊和狗等其他物种中获得的数据一致。睾丸PtO2的这一数值明显低于其他组织的氧合水平：事实上，不同的报告表明，睾丸的PtO2大约是大多数相关组织数值的一半。睾丸在相对缺氧的水平下工作这一事实被归因于精子发生过程中的新陈代谢需求导致的高耗氧量，以及睾丸增加血流量的能力减弱。因此，睾丸可能对OSA中典型的间歇性氧气不饱和血液供应特别敏感，这反映在反复缺氧(约4mmHg nadir；图1)导致的PtO2波动幅度相当大，可能对精子发生过程产生重要影响，进而影响生育能力。

众所周知，各种内源性和外源性因素(如热应激、精索静脉曲张、糖尿病、感染、缺氧)都会导致睾丸处于氧化应激状态。据报道，持续缺氧对睾丸产生影响的机制可能是通过诱导氧化应激，因为活性氧形成增加，氧化防御机制受损，导致生精细胞受损和凋亡。在这一过程中，缺氧和氧化应激相关基因出现上调。然而，在我们的间歇性缺氧实验中，所分析的三个氧化应激标记中的两个(Gpx1和Sod1)在间歇性缺氧处理的雄性睾丸中表达不足，这表明氧化保护的受损方式与持续性缺氧不同。持续缺氧会导致生殖细胞损伤和凋亡，而我们的间歇性缺氧模型则不同，它只会降低精子的运动能力和生育能力。

为了减少ROS的产生，睾丸建立了一个复杂的抗氧化系统，睾丸中的氧化应激诱导会产生一种反应，其特点是诱导SOD、GPx和谷胱甘肽转移酶(GST)活性的mRNA物种。在SOD的存在下，它们会将超氧阴离子(O2-)迅速转化为过氧化氢(H2O2)，以防止前者参与形成高度有害的羟基自由基。以这种方式产生的H2O2是一种强大的膜渗透性氧化剂，为了防止诱发脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤，必须将其迅速排出细胞。H2O2的清除要么由过氧化氢酶完成，要么由谷胱甘肽过氧化物酶完成，而在睾丸中后者占主导地位。我们认为，在我们的实验中，过氧化氢酶的水平不会受到影响，因为它在睾丸中的重要性有限。

Gpx1和Sod1表达的减少可能与精子活力和受精率(怀孕雌性减少)的降低有关。然而，间歇性缺氧组的每胎平均胎儿数并未受到影响，这表明能够使雌性受孕的雄性精子的DNA质量足以产生正常胚胎。有报道称，Sod1基因敲除小鼠(Sod1-KO)精子的体外受精能力低于野生型精子，但一旦受精，胚胎就能正常发育到囊胚期，这与我们的研究结果一致。有趣的是，Sod1-KO小鼠的精子在滴注培养基中培养期间，其精子运动能力逐渐下降，Sod1-KO精子中的脂质过氧化产物增加。最近又有研究表明，在与野生型雄性小鼠进行的精子竞争试验中，Sod1-KO小鼠的体内受精成功率为零，而且与不同基因型的雌性小鼠单独交配时几乎完全不育。此外，与我们的间歇性缺氧小鼠一致，Sod1-KO小鼠在交配行为上没有差异。我们认为，间歇性缺氧对睾丸造成的氧化损伤是由一些抗氧化酶的减少引起的，这些酶会导致精子的渐进运动能力和精子受精能力下降，而不会影响其他生殖特征，如精子生成、精子DNA质量或交配行为。

这项研究的数据有力地表明，间歇性缺氧通过氧化应激对直接参与精子发生的组织产生局部影响，可能会降低男性的生育能力。不过，间歇性缺氧也有可能影响到局部或全身的介质，而这些介质在调节生育能力方面发挥着作用。事实上，睾酮和卵泡刺激素是作用于睾丸以调节精子发生效率的两种主要内分泌信号。睾酮由位于曲细精管之间的睾丸间质中的莱德细胞产生，然后扩散到曲细精管中。由于睾酮是由Leydig细胞在局部产生的，因此男性和啮齿类动物睾丸中的睾酮水平比血清中的睾酮水平高25-125倍。虽然睾丸内高水平的睾酮可能需要在数量上维持最大的生精潜能，但在质量上，正常的生精功能只需较低的睾丸内浓度即可维持，而且睾丸内的生物可利用睾酮大大超过了通过雄激素受体(AR)与基因启动子结合调节基因表达所需的1nM。除了以Sertoli细胞为中心的睾酮和AR作用的经典模型外，越来越多的研究发现，睾酮在其他细胞类型(包括管周肌细胞和血管平滑肌细胞)中的作用也会影响曲细精管中发生的过程。然而，由于年龄、肥胖或睡眠紊乱等混杂因素，临床数据仍不清楚间歇性缺氧本身会如何影响OSA患者的睾酮水平。与明确显示睡眠不足的雄性大鼠体内睾酮浓度下降的数据相反，动物研究中关于缺氧(持续或间歇)对性激素影响的证据并不确凿，因为有报道称缺氧后血清睾酮浓度会增加、减少或没有变化。因此，关于睾酮对间歇性缺氧男性生育能力的具体作用缺乏数据，这也是本研究的局限性，值得进一步研究。

虽然有报道称OSA会引起男性性功能的改变，包括动物和患者的性欲减退和勃起功能障碍，并可能受睾酮变化的影响，但目前还没有关于生育能力的数据。除了反复发生低氧-复氧事件外，患有OSA的男性患者还面临着其他可能对精子质量和生育能力产生负面影响的挑战。其中一个潜在挑战与OSA的夜间事件直接相关：伴随大多数上气道阻塞事件的微哮鸣音导致睡眠结构紊乱。然而，目前有关睡眠改变对男性生育能力影响的信息还很少。虽然在小鼠中实施长期睡眠限制后未发现精子参数有明显改变，但最近的一项研究表明，在普通人群中，年轻男性自我报告的睡眠障碍与精子质量差之间存在关联。然而，可能影响OSA患者男性生育能力的最重要的伴随因素之一是肥胖，因为这两种疾病经常相互关联。据报道，肥胖本身就是一个会轻微但显著降低其他健康男性生育能力的因素。身体质量指数(BMI)增加对男性生育能力的这种影响有几个潜在的原因。首先，肥胖男性的生殖激素谱异常，可能会影响精子生成。其次，睾丸热应激可能在与肥胖相关的精子发生障碍中发挥作用，因为久坐会增加坐姿的影响，以及睾丸周围区域的脂肪堆积。鉴于肥胖会诱发全身氧化应激增加，体重指数增加可能损害男性生育能力的第三个机制是氧化应激引发的精子损伤。事实上，体重指数的增加与精子DNA损伤的适度增加有关。有趣的是，过高的体重指数和间歇性低氧血症单独诱发的氧化应激可能会对大部分患有OSA的男性的生育能力产生协同破坏作用。

总结

总之，这项实验研究证明了高频间歇性缺氧对精子功能的负面影响。要证实患有OSA的男性患者是否会导致生育能力下降，还需要在动物模型和患者身上进行后续研究。一方面，动物研究将有助于明确缺氧的剂量反应效应，或评估抗氧化药物治疗是否能减少间歇性缺氧对生殖健康的有害作用。此外，将间歇性缺氧与OSA其他典型合并症的实验模型相结合的动物研究(如应用实验性睡眠片段，以及使用肥胖、糖尿病或高血压小鼠)可能有助于探索潜在的协同效应。另一方面，对患者的研究应能揭示OSA与男性生育能力改变之间的潜在联系。具体来说，要确定OSA患者通过常规精液图评估的精子质量是否会下降，如果是这样，夜间氧饱和度的常规指数(经肥胖或睡眠干扰指数等其他混杂因素校正后)是否起主要作用，并探讨持续气道正压治疗是否会改善生育能力。最后，值得注意的是，由于男性年龄与OSA患病率之间的重叠时间不断增加，预计可能受到与睡眠呼吸障碍有关的生育问题影响的患者人数将会增加。事实上，由于肥胖症的流行，OSA在年轻患者中的发病率将更高，而男性的年龄则有持续推迟的趋势。具体来说，目前在不同的普通人群中，与男性生育更相关的年龄段中度到重度睡眠呼吸障碍的流行率估计从10%(30-49岁)到16%(30-39岁)和35%(40-49岁)不等。