肝脏组织病理学分析(Analysisofliverhistopathology)

在ConA注射后10小时从处死小鼠采集的肝脏左叶进行苏木精-伊红（H&E）染色以进行组织学分析。

脾淋巴细胞体外增殖及其促炎细胞因子产生分析(Invitroanalysesofproliferationofspleenlymphocytesandtheirproductionofproinflammatorycytokines)

通过密度梯度离心使用Histopaque（Sigma）从小鼠脾脏分离单核淋巴细胞（MNL）。在96孔板中，淋巴细胞（2×10⁵/孔）用溶解在补充有10%胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI培养基中的H₂（浓度分别为175、350和700µM）预处理。然后将96孔板中的细胞与ConA（1µg/ml）反应或不反应（作为对照）24小时，收集培养上清液进行TNF-α和IFN-γ的ELISA检测。96孔板中的脾淋巴细胞在总共48小时培养的最后16小时进一步与[³H]胸苷（0.5µCi）孵育，并通过放射性闪烁计数器监测增殖细胞中掺入的放射性（cpm）。

结果(Results)

H₂是动物肠道中碳水化合物发酵的副产品。研究还表明，活体小鼠胃或肝脏中的H₂浓度（约20-80µM）比表观全细胞Km（米氏常数）值高出20多倍。基于这一证据，我们假设腹部器官中如此高的H₂水平来源于肠道细菌。为了验证这一前提，给小鼠使用或不使用抗生素（磺胺甲恶唑和甲氧苄啶）处理3天，随后使用无抗生素水休养2天。此后，通过在血琼脂平板上培养新鲜粪便来确认抗生素对肠道菌群的抑制作用（对照组未处理小鼠，1.6±0.5×Log10⁹CFU/g；抗生素处理小鼠，7.0±6.1×Log10⁷CFU/g）。图1A显示了不同器官中的H₂含量。盲肠中检测到的H₂量最高，其次依次为小肠、大肠、肝脏、脾脏和血液。在大脑中检测到痕量水平的H₂。小鼠全身性使用抗生素（磺胺甲恶唑和甲氧苄啶）处理显著降低了所有测试器官中检测到的H₂量。离体粪便培养实验也证明了抗生素对H₂的影响（图1B）。这些数据证明了抗生素依赖性的H₂变化，无论是通过小鼠器官原位测量还是离体粪便培养，都表明肠道、肝脏和脾脏中的H₂直接来源于常驻细菌。

为了探究产生H₂的共生菌在肠道中的存在是否会影响小鼠对ConA诱导的肝损伤的易感性，向经过或不经过抗生素预处理的小鼠静脉注射ConA（15mg/kg）（实验方案A）。基线ALT和AST水平在预处理组和未处理组小鼠之间没有差异（图1C和D），表明抗生素没有造成肝损伤。注射后2小时测得的血清ALT和AST水平在抗生素处理小鼠中显著高于未处理小鼠（图1C和D）。组织学分析也显示，与未处理对照小鼠相比，抗生素处理小鼠的肝组织损伤更严重（见补充数据1），表明抗生素处理增加了小鼠对ConA诱导肝炎的易感性。换句话说，在没有抗生素的情况下，肠道细菌菌群的存在似乎为抵抗ConA诱导肝炎的发生提供了足够的保护。

如果肠道细菌产生的H₂是保护肝脏免受ConA诱导炎症的关键因素，那么外源性补充H₂给抗生素处理的小鼠应该能够下调肝脏炎症。因此，在实验方案B中，在ConA注射前12小时以及注射后0小时和3小时给抗生素处理的小鼠灌胃H₂水溶液。如图2B和C所示，H₂水溶液显著抑制了抗生素处理小鼠在ConA注射后6小时测得的炎症生物标志物ALT和AST的升高。重要的是，由活化T细胞产生的血清促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ的水平，也通过应用H₂在抗生素处理小鼠中被显著下调（图2D和E）。

为了研究肠道细菌来源的H₂对ConA诱导肝损伤的影响，用两种不同的大肠杆菌菌株重建抗生素预处理小鼠的菌群：(1)产H₂的大肠杆菌菌株W3110gfp⁺或(2)H₂缺陷型大肠杆菌菌株PMD23gfp⁺；然后静脉注射ConA（图3A，实验方案C；图3B，W3110gfp⁺和PMD23gfp⁺的H₂产量）。通过在含氨苄青霉素的琼脂平板上培养小鼠粪便中回收的GFP⁺细菌，证实了在供应含氨苄青霉素饮用水的小鼠中两种菌株的定植。在小鼠的小肠、大肠、盲肠和肝脏中检测到W3110gfp⁺定植小鼠的H₂量升高，而PMD23gfp⁺定植小鼠这些器官中的H₂水平仍然很低（见补充数据2；可在线获取）。与PMD23gfp⁺携带组或对照组小鼠相比，W3110gfp⁺菌株小鼠在ConA注射后6小时收集的血清中ALT和AST水平显著降低（图3C和D）。PMD23gfp⁺携带组或对照组小鼠相比，W3110gfp⁺携带小鼠血清中的TNF-α和IFN-γ水平也显著受到抑制（图3E和F）。因此，基于实验方案A、B和C的结果，肠道细菌释放的H₂似乎在抑制ConA注射诱导的肝脏炎症中发挥了作用。

人们认为从活化的T细胞释放的TNF-α和IFN-γ在ConA诱导的肝炎模型中引起肝组织损伤。因此，为了探讨H₂是否会影响ConA刺激的T细胞产生TNF-α和IFN-γ，在体外用ConA刺激脾单核淋巴细胞（MNL），并在存在或不存在H₂的情况下进行。如图4所示，与在无H₂条件下用ConA刺激MNL相比，培养基中存在H₂显著抑制了MNL的增殖（图4A）以及TNF-α和IFN-γ的产生（图4B和C）。值得注意的是，H₂本身对未刺激MNL的增殖或IFN-γ的产生均无影响。因此，这项体外研究有力地支持了H₂可以抑制ConA介导的T细胞活化的前提，而T细胞活化会导致组织破坏性的TNF-α和IFN-γ产生。

讨论(Discussion)

积累的证据表明，肠道常驻细菌在其共生宿主关系中具有宿主保护功能。然而，支持这种细菌介导的宿主保护功能的潜在机制尚不清楚。一些研究揭示，无菌小鼠的肠道血管系统与常规小鼠相比发育不良，这表明肠道共生菌可以影响宿主体内稳态血管生成的发育。然而，由于本研究表明肠道常驻菌产生的H₂对刀豆蛋白A（ConcanavalinA）诱导的小鼠肝炎具有抗炎作用，因此本研究揭示了一种由肠道定植菌介导的新型抗炎机制。如果肠道细菌释放的H₂确实如本研究的方案A、B和C所证明的那样，在抑制ConA注射诱导的肝脏炎症中发挥作用，那么共生菌促进的微毛细血管网络可能通过血流促进H₂的运输就变得合情合理。

值得注意的是，口服施用的H₂的抗炎效果高于肠道细菌释放的H₂。通常情况相反，因为细菌持续存在于肠道消化内容物中（约1克/小鼠）释放H₂，而总饮水量约为2毫升/天/小鼠，并且饮用水中的所有H₂会立即从胃中扩散出去。因此，我们研究中肠道细菌释放的H₂相对较低的抗炎效力，最可能归因于位于肠道粘膜深处或胃中的其他细菌（如据报道会消耗大量H₂的Helicobacterhepaticus）对H₂的清除。为了证明这一假设，需要对口胃肠道粘膜中产生或消耗H₂的细菌进行详细分析。

虽然以往大多数研究H₂生物学效应的研究关注的是由器官（如肝脏和大脑）缺血再灌注引起的氧化性组织损伤，但H₂是否也能影响由淋巴细胞活化引发的炎症尚不清楚。因此，本研究的创新之处在于发现共生菌产生的分子氢（H₂）似乎能抑制ConA刺激的淋巴细胞产生组织破坏性的促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ。此外，ROS可以通过上调NF-κB信号通路激活TNF-α的表达，同时它也能激活NADPH氧化酶（NOX）的表达，该酶从NADPH产生ROS。因此，炎症和氧化过程是相互关联的。ROS与炎症之间如此复杂的交叉反应表明，H₂介导的ConA刺激淋巴细胞产生的TNF-α和IFN-γ的抑制也可能涉及H₂的抗氧化效应。

总之，本研究表明，肠道定植菌释放的H₂可以抑制刀豆蛋白A（ConcanavalinA）在肝脏诱导的炎症，并且全身性抗生素处理可能改变肠道内具有宿主保护作用的共生菌群数量，最终导致肝脏中H₂浓度降低。由于大多数哺乳动物缺乏产生H₂的分解代谢酶，肠道细菌是肝脏中保护性H₂的唯一可能来源。事实上，共生菌在宿主防御中的作用之一可能是由常驻菌群产生抗炎H₂的能力所定义的。因此，外源性因素，如引入抗生素，可能会影响H₂的功能量，从而影响机体对疾病的易感性。